宗万里， 鲁　刚

(威海市产品质量监督检验所， 山东 威海　264209)



基于液相色谱—串联质谱法的鱼肉中氯霉素残留量测定

宗万里， 鲁刚

(威海市产品质量监督检验所， 山东 威海264209)

摘要：建立了鱼肉中氯霉素残留量的液相色谱串联质谱测定方法.样品用甲醇直接提取后，经C(18)固相萃取小柱净化后，注入液相色谱串联质谱仪中进行检测.利用ESI源(负离子模式)，C(18)液相色谱柱，以及SRM方法对样品中的氯霉素进行定性、定量分析.实验结果表明：方法测定结果的相对标准偏差小于6%(n=6),平均回收率大于90%,线性范围为1～10 ng/mL ,最低检出限为0.029 ng/mL.

关键词：液相色谱—串联质谱；鱼肉；氯霉素

0引言

氯霉素属于广谱类抗生素，曾被广泛应用于动物细菌性疾病的临床治疗.然而，近几年的研究发现，氯霉素具有较强的副作用，对人类健康会产生诸多不良影响，如果长期微量摄入含有氯霉素残留的食物，不仅能使大肠杆菌、沙门氏菌等菌株产生耐药性， 而且还会造成机体正常菌群失调，从而感染各种疾病.因此，对水产品中氯霉素残留量的监控与检测就显得十分重要.目前，测定食品中氯霉素残留量常用的检测方法主要有气相色谱法、气相色谱—质谱联用法、液相色谱—串联质谱法[1-5].本研究使用甲醇提取鱼肉中氯霉素残留量，再经C18固相萃取小柱净化后，直接注入液相色谱—串联质谱仪进行分析检测，取得了较好的效果，本方法与使用乙酸乙酯提取方法相比，无需去除鱼肉中的脂肪，是一种较为快速的测定鱼肉中氯霉素残留量的液相色谱—串联质谱法.

1材料与方法

1.1试剂与仪器

1)实验所用试剂包括：甲醇，色谱纯，TEDIA公司；氯霉素标准品，98.5%,0.25 g/瓶,Dr.Ehrenstorfer GmbH；实验用水为娃哈哈纯净水，1.25 L/瓶.

2)实验所用仪器包括：C18固相萃取小柱，500 mg,6 mL,ANPEL Scientific Instrument(Shanghai) Co.，Ltd.；Ultimate 3000型高效液相色谱仪，Thermo TSQ QUANTUM ULTRA三重四极杆质谱检测器(配电喷雾离子源ESI)；Hypersil Gold型反相液相色谱柱(2.1 mm×100 mm,3 μm),Thermo fisher公司；0.22μm有机相针管滤头,Agela公司;MS3 Digital型漩涡振荡器，IKA公司；样品粉碎机，九阳股份有限公司；Neofuhe23R型台式高速冷冻离心机，上海力申科学仪器有限公司.

1.2实验条件

1.2.1液相色谱条件.

实验的色谱条件为：色谱柱，C18柱，100×2.1 mm(i,d),3 μm；流动相，甲醇(A相)、水(B相).梯度条件为：0～0.5 min，10% A；0.5～6.5 min，线性增至90% A，保持2.5 min；9.0～9.5 min线性减至10% A，保持3.5 min；流速0.2 mL/min.

1.2.2质谱参考条件.

1)电离方式：采用电喷雾电离，负离子模式；喷雾电压为3 000 kV；鞘气(N2)压力为30(arbitrary units)；辅助气(N2)流量为10(arbitrary units)；碰撞室(氩气)压力为1.5 m Torr.

3)扫描方式：选择反应监测(Selective Reaction Montoring,SRM)方式；母离子：320.9，子离子：152.1(定量离子，碰撞能量22 eV)、121.2(碰撞能量17 eV)、176.1(碰撞能量39 eV)；质谱divert valve状态：0～8.0 min处于waste状态，8～10 min处于load状态，10～13 min处于waste状态.

1.3溶液配制与样品处理

1.3.1标准溶液的制备与处理.

准确称取50 mg的氯霉素标准品至50 mL容量瓶中，用甲醇定容，得1 000 μg/mL的氯霉素标准溶液.准确吸取0.1 mL的氯霉素标准溶液至100 mL容量瓶中，用甲醇定容，得1 μg/mL的氯霉素标准溶液.再从1 μg/mL的氯霉素标准溶液中，分别吸取0.02、0.04、0.08、0.16、0.20 mL分别加入到5个各加入5 g含氯霉素空白鱼肉样品的容量为50 mL带有刻度的离心管中，用甲醇溶液定容至20 mL，旋涡混合器提取2 min，在高速离心机上以8 000 r/min离心5 min，之后吸取上清液2 mL过柱净化，得1、2、4、8、10 ng/mL的标准系列工作溶液.每个浓度溶液经0.22 μm针管有机滤膜过滤后，取10 μL注入高效液相色谱—串联质谱仪进行分析.

1.3.2样品前处理.

1)样品的处理.称取5.0 g(精确至0.01 g)粉碎后的样品于50 mL具塞刻度管中,试样用甲醇定容至10 mL,摇匀后于旋涡混合器提取2 min，在高速离心机上以8 000 r/min离心5 min，之后吸取上清液2 mL过柱净化.

2)净化.取C18固相萃取小柱，先后加入1柱管体积甲醇，1柱管体积水对小柱活化，加入2 mL样品处理液紧接着再加入1柱管体积水洗脱杂质，最后用甲醇洗脱定容至2 mL.

2结果与讨论

2.1标准曲线的制作

本研究使用空白基质加标后的样品处理液作为标准系列溶液来绘制标准曲线，与直接使用溶剂来配置相比，能够降低回收率的影响，同时能够校正在离子源处样品基质产生的基质效应.

2.2样品前处理

由于氯霉素易溶于甲醇等有机溶剂，本研究采用甲醇直接浸泡鱼肉提取其中氯霉素的残留量，鱼肉样品经过甲醇提取后，再经过C18固相萃取小柱除去提取液中可能溶有的蛋白质、脂肪以及极性杂质，以减小蛋白质在液相色谱柱上的不可逆吸附，在保护色谱柱的同时能够减少对质谱检测器的离子源污染.

2.3色谱及质谱条件

本研究采用反相色谱柱C18(100 mm×2.1 mm,3 μm),在梯度洗脱的条件下对氯霉素进行分离，氯霉素的出峰时间为9 min左右，可见氯霉素在反相柱上有较强的保留，氯霉素峰型尖锐，流动相的条件合适.在质谱检测器方面，利用质谱检测器自身的方法优化功能，选出母离子320.9的3个丰度最强的子离子，其中1个丰度最强的子离子设为定量离子，其余2个设为定性参考离子，然后优化出3个子离子的最佳碰撞能量.由于氯霉素在9 min出峰，在质谱检测器端使用切换阀，将流动相在8～10 min切进离子源，其他时间将流动相切出质谱检测器，使流动相不经过离子源，以减少离子源的污染.

2.4色谱图

在“1.2”项的色谱及质谱条件下,得到氯霉素标准样品在SRM方式下的总离子流图、SRM质谱图、空白样品的总离子流图、加标空白样品的总离子流图，具体如图1～4所示.由图可见，加标样品谱图干净，氯霉素出峰良好，无干扰.在本研究色谱条件下，实验结果良好.

图1氯霉素标样SRM方式下的总离子流图

图2氯霉素标样SRM方式下的质谱图

图3　样品SRM方式下的TIC色谱图

图4加标样品SRM方式下的TIC色谱图

2.5标准曲线和最低检出限

在本实验条件下，以峰面积y为纵坐标，质量浓度x(μg·mL-1)为横坐标绘制标准曲线，得线性方程，以基线噪声3倍峰面积对应的质量浓度为检出限(S/N=3)，回归方程、相关系数及检出限见表1.

表1　回归方程的基本参数

2.6精密度和加标回收实验

取不含氯霉素的鲜鱼肉样品进行加标回收实验，向5g样品中分别添加1 μg/mL氯霉素标准溶液0.02、0.05、0.1 mL，即样品中氯霉素含量为分别为4、10、20 μg/kg.按前述样品处理方法进行样品处理，重复6次.按“1.2”项及“1.3”项色谱、质谱条件及处理方法进行测定，精密度和回收率计算结果见表2.

由表2可知，采用本方法所得实验结果满足检测要求.

表2　样品精密度和加标回收实验

3结论

通过实验建立了鱼肉中氯霉素残留量测定的液相色谱—串联质谱检测方法，该方法前处理简单快速.由于使用固相萃取柱对样品处理液进行了净化，能保护色谱柱并降低样品处理液对离子源的干扰.同时，本方法的精密度与回收率均能满足要求，可为水产品中氯霉素残留量的检验与监测提供科学依据与技术支持.

参考文献:

[1]中华人民共和国农业部.SC/T 3018-2004水产品中氯霉素残留量的测定——气相色谱法[S].北京:中国农业出版社,2004.

[2]中华人民共和国农业部.农业部958号公告-13-2007水产品中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素残留量的测定——气相色谱法[S].北京:中国农业出版社,2007.

[3]中华人民共和国农业部.农业部781号公告-1-2006动物源食品中氯霉素残留量的测定——气相色谱—质谱法[S].北京:中国农业出版社,2006.

[4]贾宏新,邹淼,林盛.超高效液相色谱—串联质谱法测定河蟹中氯霉素类药物残留量[J].中国卫生检验杂志，2013,23(13):2726-2729.

[5]薄尔琳，郑怀东，刘学光，等.同位素稀释液相色谱—串联质谱法快速测定海参中氯霉素[J].中国渔业质量与标准,2013,3(4):36-41.

Determination of Chloramphenicol Residue in Fish Meat by LC-MS/MS

ZONGWanli，LUGang

(Weihai Supervision and Inspection Institute of Product Quality, Weihai 264209, China)

Abstract:A method for determination of Chloramphenicol residue in fish meat by liquid chromatography-Tandem mass spectrometry(LC-MS/MS) is established．The sample is injected into LC-MS after being extracted by methanol and cleaned by the C(18) SPE tubes.The quantitative and qualitative analysis is done by ESI source under negative ion mode,C(18) liquid chromatography column and SRM.The experimental results show that the RSD of the method is less than 6%(n=6),the average recovery is more than 90%,the liner range is 1～10 ng/mL and the low detection limit is 0.029 ng/mL.

Key words：LC-MS/MS;fish meat;chloramphenicol;residue

中图分类号：O657.63；TS254.7

文献标志码：A

作者简介：宗万里(1981 — )， 男， 工程师， 从事食品成分检测技术研究.

收稿日期：2015-10-26.

文章编号：1004-5422(2016)01-0027-03