吴　靖,周宏斌,潘松青

(1.襄阳市中心医院神经内科,湖北 襄阳　441021；2.武汉大学人民医院神经内科,湖北 武汉　430060)



莲心碱对氯化锂—匹鲁卡品致癫模型急性期皮层脑电图的影响

吴靖1,周宏斌1,潘松青2

(1.襄阳市中心医院神经内科,湖北 襄阳441021；2.武汉大学人民医院神经内科,湖北 武汉430060)

摘要：目的探讨莲心碱对氯化锂—匹鲁卡品致癫大鼠模型急性期皮层脑电图的影响。方法32只SD大鼠随机分为生理盐水对照组(A组,10 μg)、低剂量莲心碱组(B组,莲心碱2.5 g·L(-1),25 μg)、高剂量莲心碱组(C组,莲心碱5 g·L(-1),50 μg)、左乙拉西坦组(D组,100 g·L(-1),1 mg),建立氯化锂—匹鲁卡品癫痫大鼠模型后侧脑室注射药物,记录各组大鼠脑电图的改变。结果莲心碱组及左乙拉西坦组与对照组相比大鼠的痫性放电频率减低,快波(β波)比率减少,慢波(δ波)比率增加； 高剂量莲心碱组和左乙拉西坦组相比无统计学差异。结论莲心碱在氯化锂—匹鲁卡品癫痫大鼠模型急性期具有抗癫痫作用。

关键词：癫痫；莲心碱；氯化锂；匹鲁卡品；皮层脑电图

癫痫是神经科的常见病、多发病,抗癫痫药物能控制80%患者的发作,仍约有20%左右的癫痫对现有的药物治疗无效成为难治性癫痫[1],因此开发更高效的抗癫痫药物是当前癫痫研究的热点。目前抗癫痫药物主要是以钠离子通道、钙离子通道、钾离子通道、谷氨酸受体、 GABA 通路及中枢突触囊泡前膜蛋白等为靶点[2],其中阻滞离子通道是重要的作用机制之一[3]。莲心碱(liensinine)是一种从中药莲子心中提出的双苄基异哇琳单醚键型生物碱,大量研究证实其对Na+、K+、Ca2+的跨膜转运具有抑制作用[4],亦有实验证实莲心碱能抑制青霉素致痫大鼠皮层脑电图癫痫样放电[5]。本实验通过观察莲心碱对氯化锂—匹鲁卡品致癫大鼠皮层脑电图的影响,进一步研究莲心碱的抗癫痫作用。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物清洁级健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠32只,实验起始体质量(210±30)g,由华中科技大学同济实验动物中心提供,许可证号：SCXK(鄂)2004-0007。

1.1.2药品及仪器 匹鲁卡品(pilocarpine,Pilo)购自美国FLUKA公司；氯化锂(lithium chloride,LiCl2)购自武汉亦新生物技术有限公司；硫酸阿托品购自芜湖康奇制药有限公司；莲心碱由武汉李时珍药业公司制备(武汉大学人民医院药学部提供原料,纯度≥98%)；乌拉坦购自国药集团化学试剂有限公司。

RM6240生物信号采集处理系统(成都仪器厂生产)；江湾Ⅱ型立体定向仪(第二军医大学器材处)；微量进样器(上海安亭微量进样器厂)；不锈钢套管针(武汉大学生理教研室提供)。

1.2方法

1.2.1癫痫动物模型制作经腹腔注射氯化锂(0.125 g·kg-1),18～24 h后注射硫酸阿托品(1 mg·kg-1),30 min后再腹腔注射匹鲁卡品(100 mg·kg-1)。根据Racine(1972)发作分级标准[6]达到Ⅳ～Ⅴ级发作0.5 h视为模型建立成功。

1.2.2侧脑室置管及脑电图描记模型建立成功后大鼠腹腔注射乌拉坦麻醉,固定于脑立体定位仪上。沿大鼠正中矢状线切开皮肤,暴露颅骨及前后囟,剥离骨膜。根据George Paxions图谱,坐标为前囟后1 mm,中线左侧1.5 mm,深度4 mm,定位左侧脑室,置入套管针备用。在前囟后6.3 mm,中线左右各旁开4.3 mm；人字缝后2 mm正中,用牙钻钻孔至硬脑膜,安置三个皮层电极,与RM6240生物信号采集处理系统连接。记录参数为纸速400 ms/div,灵敏度500 μV·mm-1,滤波100 Hz,时间常数0.02 s。

1.2.3动物分组及处理32只大鼠(实验共使用SD大鼠35只,32只模型成功)随机分为生理盐水对照组(A组)、低剂量莲心碱组(B组)、高剂量莲心碱组(C组)、左乙拉西坦组(D),每组各8只。各组记录皮层脑电图30 min后使用微量进样器经套管针分别缓慢注射生理盐水(10 μL),低剂量莲心碱(2.5 g·L-1,10 μL),高剂量莲心碱(5 g·L-1,10 μL),左乙拉西坦(100 g·L-1,10 μL),继续记录150 min。比较单位时间癫痫样放电频率的变化以及对脑波频段分布的影响。

2结果

2.1正常大鼠皮层脑电图和氯化锂—匹鲁卡品致癫大鼠皮层脑电图 正常大鼠皮层脑电图以α、θ波为主要波形,波幅小于75 μV。氯化锂—匹鲁卡品致癫大鼠皮层脑电图表现为成簇性发放的棘波、尖波节律以及棘—慢、 尖—慢复合波等多种形式的癫痫样放电(波幅100～1 000 μV,见图 1)。

正常大鼠脑电图氯化锂—匹鲁卡品致癫大鼠模型皮层脑电图

图 1大鼠皮层脑电图

2.2各组大鼠脑电图癫痫样放电的变化 选用各组大鼠注射前30 min脑电图痫样放电与同组大鼠注射后每30 min进行比较。生理盐水对照组皮层脑电图呈成簇性发放的棘波、尖波节律,并可见棘—慢及尖—慢复合波等多种形式的癫痫样放电(波幅100～1 000 μV),注射前后痫样放电频率无明显变化。低剂量莲心碱组、高剂量莲心碱组和左乙拉西坦组皮层脑电图可见棘波、尖波、棘—慢综合波、尖—慢综合波等痫样放电频率较注射前明显降低(图2,表1)。

生理盐水对照组　　　　　　　　　　　　　　　　　　　低剂量莲心碱组

高剂量莲心碱组　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　左乙拉西坦组

组别给药前30min给药后/min0～3030～6060～9090～120120～150生理盐水组7910±12577981±16027793±16797439±19197178±18677578±1935低剂量莲心碱组8327±17737468±24416982±29065836±26674955±23934700±2018*高剂量莲心碱组7748±10156909±13714833±15833792±16383486±17052633±1353左乙拉西坦组7489±11095570±14714207±19603733±16693671±16983399±1579

注：与同组前30 min比较,*P<0.01。

对各组痫样放电的频率变化进行组间对照,高剂量莲心碱组及左乙拉西坦组与对照组相比有统计学差异(P<0.05),高剂量莲心碱组与左乙拉西坦组之间无统计学差异(P=0.513)。

2.3各组大鼠脑电图频段分布的变化 选用各组大鼠注射前30 min脑电图各脑波的频段分布与同组大鼠注射后每30 min脑波频段分布进行比较。生理盐水对照组皮层脑电图以α、θ频段为主,其中以θ波频段所占比率最大,注射前后皮层脑电图各频段分布无明显变化。低剂量莲心碱组、高剂量莲心碱组和左乙拉西坦组药物注射后快波(α、β波)频段所占比率减少(P<0.05),慢波(θ、δ波)频段所占比率增加(P<0.05)(表2)。

3讨论

癫痫是一组由脑神经元反复发作的异常放电所引起的以中枢神经系统短暂性功能失常为特征的慢性脑部疾病。其发病机制非常复杂,目前较一致的观点是癫痫系中枢神经系统兴奋与抑制不平衡所致,而这种不平衡主要与离子通道、突触传递及神经胶质细胞等等的功能和结构改变有关。近年的研究发现电压依赖性钠通道1亚基(SCN 1A )基因突变与热性惊厥相关癫痫或癫痫伴热性惊厥附加症(EFS+),尤其伴失神、肌阵挛或者失张力性等全面发作为主的全面性癫痫伴热性惊厥附加症(GEFS+)、相关性颞叶癫痫、部分性癫痫伴热性惊厥附加症(PEFS+)和婴儿重症肌阵挛性癫痫(Dravet综合征)的关系密切,突变造成的钠通道功能障碍是其可能的发病机制[7-9],进一步证实了离子通道结构和功能的变化与癫痫发病的相关性。

作为一种从中药莲子心中提取出的双苄基异哇琳单醚键型生物碱,莲心碱能影响心肌慢反应动作电位及慢内向电流,降低离体兔窦房结(SAN)起搏细胞慢反应动作电位幅度(APA)及零相最大上升速率 (Vmax),延长窦性周长(SCL)；能明显拮抗Bayk8644增大SAN起搏细胞及高K+诱发的豚鼠乳头肌慢反应动作电位的APA和Vmax作用,抑制犬浦肯野氏纤维慢向内流；莲心碱还能对抗乙酰胆碱缩短动作电位时程的作用,提示莲心碱对Na+、K+、Ca2+的跨膜转运具有抑制作用[4]。鉴于这些基础,我们通过实验探讨莲心碱对癫痫的作用。

±s,n=8)

注：与同组给药前30 min比较，#P<0.05。

左乙拉西坦是一种新型的抗癫痫药物,2005年美国食品药品监督局(FDA)审批通过其片剂和口服液制剂适合应用4岁以上儿童和青少年的癫痫初次发作的联合药物治疗,2007年通过我国的审批广泛应用于临床诊疗工作,取得的较好的疗效[10]。研究发现左乙拉西坦能显著缩短除最大电休克模型及戊四氮模型以外几乎所有癫痫动物模型癫痫发作的时程,降低其痫性放电的频率[11-12]。其中匹鲁卡品动物模型建立前腹腔注射左乙拉西坦可以使痫样放电的潜伏期延长；可以抑制53%的痫样放电,减少58%的癫痫持续状态发生；可以使模型死亡潜伏期延长116%,死亡率降低61%；同时能显著延缓海马皮质的同步化痫性放电[13-14]。而每日胃肠道给左乙拉西坦,2周后匹鲁卡品模型痫样放电亦较处理前显著减低[15]。所以实验中我们选用左乙拉西坦作为阳性对照,评价莲心碱在匹鲁卡品模型中的抗癫痫作用。

本实验于匹鲁卡品癫痫模型建立后随即侧脑室注射莲心碱,结果显示注射后模型大鼠皮层脑电图痫样放电频率明显下降。其中低剂量莲心碱组注射后60 min痫样放电频率即有下降,以每15 min为单位进行分析,60～75 min下降有统计学意义(P<0.05),75～90 min下降有显著统计学意义(P<0.01)；高剂量莲心碱组注射30 min后放电频率开始下降,30～45 min下降有统计学意义(P<0.05),45～60 min下降有显著统计学意义(P<0.01)；左乙拉西坦组痫样放电频率在注射后即开始下降；生理盐水对照组注射后痫样放电则无明显变化。我们进一步组间比较后发现高剂量莲心碱组与左乙拉西坦组对模型大鼠脑电图痫样放电频率的影响无统计学差异(P=0.513)。此结果表明莲心碱可以抑制匹鲁卡品大鼠模型的痫样放电,功效与左乙拉西坦相当,并在一定范围内呈量效相关性。

实验同时显示与药物注射前30 min模型大鼠脑电图的脑波频段分配相比,莲心碱组及左乙拉西坦组药物注射后都出现脑电图β波频段所占比率明显下降,而生理盐水组无明显变化。匹鲁卡品癫痫模型急性期脑电图癫痫样放电以成簇的棘波节律为主,而棘波在脑电频段分布中属于β波范畴。此结果提示莲心碱对脑电图脑波频段分配的影响与对癫痫样放电频率的影响一致,从而在脑波频段分配上也证明莲心碱可以抑制匹鲁卡品癫痫模型的痫样放电。

目前人类对癫痫发病机制的研究主要依靠动物实验,癫痫产生机制的探讨和最新进展亦多直接或间接来于动物模型研究[16]。匹鲁卡品癫痫模型是一种符合人类癫痫发生发展特征的癫痫模型,呈典型的3期表现：一期表现为癫痫持续状态的急性期(持续6～24 h),EEG表现连续高波幅、高频率的棘波、棘慢波发放；二期表现为行为与EEG均正常的静止期(持续平均14 d)；三期为表现自发性、反复性发作的慢性期,EEG可见突出于平坦背景波的周期性癫痫样放电。同时病理学研究证实匹鲁卡品能诱发海马区神经元死亡及苔藓出芽,因此氯化锂—匹鲁卡品致模型既可用于急性癫痫持续状态模型的研究,又是理想的慢性颞叶癫痫模型[17]。我们的实验结果证实莲心碱作为一种对离子通道有明确阻滞作用的药物,在氯化锂—匹鲁卡品癫痫大鼠模型急性期对癫痫样放电具有抑制作用,作用与左乙拉西坦相当。由此我们推断莲心碱是一种潜在的具有抗癫痫持续状态及抗颞叶癫痫作用的药物,其作用机制可能与阻滞离子通道从而减少脑神经元的异常放电有关,其具体途径有待于进一步研究。

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Effect of liensinine on electrocorticogram in lithium-pilocarpine induced acute epilepsy rats

WU Jing1,ZHOU Hong-bing1,PAN Song-qing2

(1.DepartmentofNeurology,XiangyangCentralHospital,Xiangyang,Hubei441021,China；2.DepartmentofNeurology,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan,Hubei430060,China)

Abstract：ObjectiveTo explore the effect of liensinine on electrocorticogram in lithium-pilocarpine induced acute epilepsy rats.MethodsThirty-two SD rats were randomized into four groups (8 rats in each group):epilepsy model group(group A,10 μg),low dose of liensinine group(group B,2.5 g·L(-1),25 μg),high dose ofliensinine group(group C,5 g·L(-1),50 μg),levetiracetam group (group D,100 g·L(-1),1 mg).Electrocorticogram of rats was recorded after lithium-pilocarpine model was induced and the drug wasintra-cerebroventricular injected.ResultsCompared with group A,the epileptic discharge was significantly decreased in groups B,C and D (P<0.05).The proportion of δ slow wave was enhanced,meanwhile β fast wave was decreased in groups B,C and D.And there was no significant difference between high dose of liensinine group and levetiracetam group.ConclusionsLiensinine has the role of anti-epilepsy in acute model of epileptic rats induced by lithium-pilocarpine.

Key words：epilepsy;liensinine;lithium;pilocarpine;electrocorticogram

(收稿日期:2015-08-21,修回日期：2015-10-09)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.03.011

通信作者：潘松青,男,主任医师,硕士生导师,研究方向:癫痫及神经电生理,E-mail：p.s.q.@medmail.com.cn