权文强，吴军录，姚懿雯，万海英，李冬(上海市同济医院，上海200065)



苯基乙酰对小鼠移植性肺癌的抑制作用及其机制

权文强，吴军录，姚懿雯，万海英，李冬(上海市同济医院，上海200065)

摘要：目的观察苯基乙酰(PG)对肺癌的抑制作用，并探讨其作用机制。方法选择C57BL/6小鼠40只，尾静脉注射肺癌LLC细胞建立肺癌模型。随机将成模小鼠分为PG组、PBS组各20只，PG组腹腔内注射800 mg/kg PG，PBS组腹腔内注射等量PBS，连续10天。两组各随机取5只，计数肺肿瘤个数、测量肿瘤最大直径；各随机取5只，采用Western blotting法观察肺癌组织Bcl-2、Bcl-XL、细胞凋亡抑制蛋白1(cIAP1)、Survivin、增殖细胞核抗原(PCNA)表达。剩余小鼠收集支气管肺泡灌洗液(BALF)，取5只小鼠的BALF，检测炎症细胞(包括WBC总数及分类)及炎症因子(TNF-α、IL-6、趋化因子)；剩余小鼠的BALF，采用电泳迁移位移试验观察NF-κB DNA结合活力。结果与PBS组比较，PG组肺肿瘤个数和肿瘤最大直径明显减少或降低(P均<0.05)。Western blotting结果显示，PG组Bcl-2、Bcl-XL、cIAP1、Survivin及PCNA表达均明显下调，BALF中巨噬细胞中NF-κB与靶DNA结合活性明显被抑制。与PBS组比较，PG组可显著降低BALF中各种炎性细胞数量及炎症因子水平(P均<0.05)。结论PG能明显抑制小鼠肺癌的生长，其机制与诱导肿瘤细胞凋亡、抑制巨噬细胞中NF-κB活性、减轻肺部炎症反应有关。

关键词：肺癌；苯基乙酰；巨噬细胞；核因子-κB；炎症反应；小鼠

炎症免疫细胞在肿瘤的发展中扮演重要角色，如巨噬细胞，其数量与肿瘤预后有关[1]；侵入肿瘤的巨噬细胞及其释放的大量可溶性炎症介质(如TNF-α、IL-6)，可促进肿瘤细胞增殖、浸润和转移[2]。研究发现，NF-κB能够调节肿瘤细胞增殖和生存时间，促进血管形成、细胞侵袭和肿瘤转移，在多种肿瘤形成中具有重要作用，如肺癌、结肠癌等[3,4]。尿多酸肽(CDA-2)是从健康人尿液中分离、提取的一种抗肿瘤新药[5]，对白血病、肝癌、肺癌等均有抑制作用[6～8]。苯基乙酰(PG)是CDA-2的主要成分，但其是否为CDA-2的主要作用成分尚不清楚。2014年2～9月，我们观察了PG对小鼠移植性肺癌的抑制作用，并对其作用机制进行初步探讨。

1材料与方法

1.1材料雌性C57BL/6小鼠40只，6～8周龄，体质量18～24 g，由国家啮齿类实验动物中心上海分院提供，饲养于同济大学附属同济医院SPF级无菌实验室。LLC细胞，美国标准细胞培养所；细胞培养用青霉素、链霉素、DMEM培养基，美国Hyclone公司；FBS，美国Invitrogen公司；PG，美国Sigma公司。鼠抗Bcl-XL、Bcl-2，美国Santa Cruz公司；鼠抗增殖细胞核抗原(PCNA)、兔抗细胞凋亡抑制蛋白1(cIAP1)、兔抗Survivin，英国Abcam公司；鼠抗β-actin，美国Sigma公司。HRP结合的羊抗兔，美国Santa Cruz公司；HRP结合的兔抗鼠，丹麦Dako公司。

1.2模型制备及动物处理传代培养LLC细胞，取对数生长期细胞用于实验。随机将小鼠分为PG组、PBS组各20只。两组均尾静脉注射LLC细胞2×105个。注射第14天开始，PG组腹腔内注射PG 800 mg/kg，PBS组腹腔内注射等体积PBS；均连续10天。

1.3相关指标观察

1.3.1肺肿瘤情况观察腹腔内注射药物第10天，随机各取5只处死，取出荷瘤肺，4%多聚甲醛固定。固定24 h，石蜡包埋，350 μm厚连续切片，HE染色，计数肺肿瘤个数，并测量肿瘤最大直径。

1.3.2抗凋亡及增殖相关因子检测采用Western blotting法。随机各取5只，显微镜下用18G针头分离肺肿瘤组织，取10 mg置于500 μL含有PMSF及Cocktail蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液中，用组织匀浆器充分匀浆后置冰上30 min，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，取上清；采用BCA试剂盒测定BCA蛋白浓度，调整浓度一致后加入5×loading煮沸10 min。取30 μg样本上样于10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶，电泳，冰浴转膜。5%脱脂奶粉封闭1 h，加一抗孵育过夜，相应二抗杂交。采用ECL化学发光剂显影，压片，观察Bcl-XL、Bcl-2、cIAP1、Survivin、PCNA表达。

1.3.3炎症细胞及炎症因子检测剩余小鼠，经气管对荷瘤肺进行PBS灌注，收集支气管肺泡灌洗液(BALF)。各取5只检测炎症细胞及炎症因子。采用血细胞计数仪计数WBC总数，计数细胞后，离心涂片，选择任意视野计数100个白细胞，对白细胞进行分类。采用双抗体夹心ELISA法检测TNF-α、IL-6、趋化因子(KC)，所有操作严格按试剂盒说明书进行。

1.3.4NF-κB DNA结合活力检测采用电泳迁移位移试验。取剩余5只小鼠的BALF，置于含DMEM的细胞培养皿中，37 ℃ 5% CO2培养箱中孵育1 h，培养皿用PBS洗3次，收集贴壁细胞，主要为巨噬细胞。按核蛋白抽提试剂盒说明对肺泡巨噬细胞进行核浆蛋白分离。核蛋白用带32p标记的双链NF-κB序列探针在室温孵育30 min，DNA-蛋白混合物上样于4%聚丙烯酰胺凝胶，0.5×TBE电泳缓冲液，300 V电压电泳。凝胶干燥，-80 ℃ ECL显影。

2结果

2.1两组肿瘤形成情况比较PBS组及PG组肿瘤个数分别为(45.2±10.5)、(9.6±3.0)个，肿瘤最大直径分别为(5.4±0.8)、(1.7±0.6)mm。两组比较，P均<0.05。

2.2两组抗凋亡及增殖相关因子表达情况Western blotting结果显示，Bcl-XL、Bcl-2、cIAP1相对灰度值分别下降至0.53±0.05、0.42±0.03、0.27±0.04；凋亡抑制因子Survivin含量亦明显减少，相对灰度值下降至0.39±0.03。同时发现，PCNA表达亦明显下降，相对灰度值下降至0.29±0.02。见插页Ⅱ图4。

2.3两组BALF中炎性细胞及炎性因子水平比较见表1、2。

表1　两组BALF中白细胞总数及分类比较

注：与PBS组比较，*P<0.05。

2.4两组NF-κB DNA结合活力情况见插页Ⅱ图5。与PBS组比较，PG处理显著抑制BALF中巨噬细胞NF-κB与靶DNA结合活性，同时对肿瘤细胞的NF-κB活性也有显著抑制作用， 相对灰度值下降至0.13±0.02。

表2　两组BALF中TNF-α、IL-6、KC

注：与PBS组比较，*P<0.05。

3讨论

CDA-2有多个活性部分，如PG、苯甲酰-乙二醇、4-羟基-苯基酸等。有研究认为，PG可能在其抗癌中起主要作用[6]。PG在体外的抑癌作用可能是通过上调过氧化物酶激活受体和抑制PI3/Akt信号传导通路来实现[8]。

肿瘤细胞微环境包括免疫细胞[如肿瘤相关巨噬细胞(TAM)]和结缔组织(如成纤维细胞、内皮细胞等)，对肿瘤的发生、发展具有重要作用[2]。TAMs通过释放炎性细胞和趋化因子形成新生血管，促进肿瘤侵袭和转移，导致肺癌患者预后较差[1～4]。本研究结果显示，PG组BALF中炎症细胞数明显少于PBS组。推测PG可能是通过抑制炎性免疫细胞数量、减轻炎性反应来抑制肺癌细胞增殖。

活化的NF-κB是诱导多种肿瘤发生的重要靶基因[9，10]。在炎性细胞中，活化的NF-κB控制着炎性因子的产生，如TNF、IL-6和KC等。这些因子能够诱导肿瘤发生和促进肿瘤细胞增殖。活化的NF-κB在肿瘤细胞中亦有同样作用，能够促进肿瘤血管形成、细胞侵袭和转移。而敲除髓系细胞和肺癌上皮细胞的NF-κB能降低肺癌发生风险[11～14]。近年来，通过体外培养人类白血病和MDS细胞系发现，PG能够通过影响IkBa磷酸化和降解阻止NF-κB核易位而抑制NF-κB活性[6]。由此推测，PG抑制肺癌生长可能涉及NF-κB的调控。本研究发现，PG能够显著降低肺泡巨噬细胞中NF-κB与靶DNA结合活性，提示PG能够通过抑制肺泡巨噬细胞中NF-κB激活来抑制肺癌细胞增殖。

Toll样受体(TLR)通常在髓系细胞表面表达，通过激活NF-κB诱导炎症因子的产生和释放，在机体的先天免疫中行使重要功能。近年研究发现，在肺癌微环境中，TAM表面的TLR2介导NF-κB激活，增强TNF-α、IL-6等因子的释放，促进肺肿瘤生长[15]。因此，PG抑制NF-κB激活过程可能涉及TLR，特别是TLR2；通过抑制TLR2、阻断NF-κB激活可能是PG的抗炎作用机制。有研究报道，抑制肿瘤细胞中NF-κB活性可使肺癌、乳腺癌、结肠癌等细胞增殖停滞，并促使其凋亡[16]。因此不排除PG对肺癌细胞具有直接抑制增殖、促进凋亡的作用。

综上所述，PG能抑制小鼠肺癌的生长，其机制与诱导肿瘤细胞凋亡、抑制巨噬细胞中NF-κB激活、减轻肺部炎性反应有关。

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Inhibitory effect of phenylacetylglutamine on metastatic lung caner of mice

QUANWenqiang,WUJunlu,YAOYiwen,WANHaiying,LIDong

(TongjiHospitalofTongjiUniversity,Shanghai200065,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the inhibitory effect of phenylacetylglutamine (PG) on lung caner and to investigate the mechanism. MethodsThe lung cancer metastasis models in C57BL/6 mice was generated by intravenous injection of Lewis lung carcinoma (LLC) cells. Then the model mice were randomly divided into PG group (n=20) which was injected with 800 mg/kg PG and PBS group (n=20) which was injected with the same amount of PBS, both for 10 days. We randomly took 5 mice in each group to calculate the tumor count and measure the size of tumor. We randomly took 5 mice in each group to detect the expression of Bcl-2, Bcl-XL, cIAP1, Survivin and PCNA proteins by Western blotting. The broncho alveolar lavage fluid (BALF) from 5 mice were collected to detect inflammatory cells and inflammatory factors (TNF-α, IL-6, KC). The electrophoretic mobility shift assay (EMSA) was used to detect the NF-κB DNA binding ability. ResultsCompared with the PBS group, the growth of lung tumors in mice was inhibited, and tumor number and tumor size decreased significantly in the PG group (P<0.05). The expression of Bcl-2, Bcl-XL, cIAP1, Survivin and PCNA was significantly decreased in the PG group. In BALF of the PG group, binding activity between NF-κB and target DNA was strongly suppressed. Compared with the PBS group, the number of BALF of various inflammatory cells and inflammatory cytokines were significantly reduced in the PG group (all P<0.05). ConclusionPG can inhibit the development of lung tumor, and the mechanism may be related with inducing lung tumor cell apoptosis, inhibiting the activation of NF- κB, and reducing the inflammatory reaction.

Key words:lung cancer; phenylacetylglutamine; macrophage; nuclear factor-kappa B; inflammation reaction; mice

(收稿日期：2015-09-29)

中图分类号：R734.2

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)08-0020-03

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.08.007

通信作者简介：李冬(1974-)，男，副教授，研究方向为肿瘤的分子诊断。E-mail： 186ld@163.com

作者简介：第一权文强(1985-)，男，硕士研究生，研究方向为炎症与肿瘤的关系。E-mail： qwq1985@126.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81272603，81472179)；上海市浦江人才计划(13PJ1407300)；上海申康医院发展中心市级医院临床辅助科室能力建设项目(SHDC22014008)。