龙思琪　马　莉　陈　敏　李　虹

(贵州医科大学附属医院中心实验室，贵阳550004)



婴幼儿重症和非重症肺炎淋巴细胞亚群的差异分析①

龙思琪马莉陈敏②李虹

(贵州医科大学附属医院中心实验室，贵阳550004)

[摘要]目的：观察重症肺炎和非重症肺炎患儿淋巴细胞亚群水平，探讨患儿的细胞免疫功能变化并为临床治疗提供参考。方法：收集重症肺炎患儿27例、非重症肺炎(普通肺炎)患儿28例以及20例健康对照，采用流式细胞术检测研究对象外周血中CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD19+B、CD16+CD56+NK细胞的水平，并进行比较分析。结果：重症肺炎组CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T淋巴细胞及NK细胞比例明显低于健康对照(P<0.01，P<0.05，P<0.01，P<0.05)，而CD4/CD8比值、CD19+B淋巴细胞比例则显著高于健康对照组(P<0.05，P<0.01)；非重症肺炎组CD3+CD8+T淋巴细胞低于健康对照(P<0.01)，而CD19+B淋巴细胞比例则显著高于健康对照组(P<0.01)；与非重症肺炎组相比，重症肺炎组CD3+T、CD3+CD8+T淋巴细胞比例显著降低(P<0.01)，而CD19+B淋巴细胞比例则明显升高(P<0.01)。结论：重症与非重症肺炎患儿机体存在明显的细胞免疫功能紊乱，重症肺炎患儿的细胞免疫功能受损更为严重，为临床评估病情及免疫治疗提供一定的理论依据。

[关键词]重症肺炎；T淋巴细胞亚群；CD19+B淋巴细胞；细胞免疫功能

肺炎是儿科的常见病，重症肺炎或可由于肺炎治疗不及时而导致，占肺炎7%～13%[1]，其起病快、并发症多、常累及全身，是引起婴幼儿死亡的主要原因[2]。婴幼儿免疫系统尚未发育完全，监测淋巴细胞亚群变化，可反映婴幼儿体内细胞免疫功能状态。本文旨在探讨重症与非重症肺炎患儿的免疫功能变化，为临床评估病情严重程度变化及指导治疗提供参考价值。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1伦理声明本研究符合《赫尔辛基宣言》，并通过贵州医科大学附属医院伦理委员会批准并出示证明。所有研究对象家长均知情同意。

1.1.2一般资料选择2014年4月至2015年6月的贵阳市儿童医院收治重症肺炎患儿27例，其临床诊断符合2005年中华医学会儿科学分会《2005年全国小儿社区获得性呼吸道感染专题研讨会纪要》、《医院获得性肺炎诊断和治疗指南》中重症肺炎诊断标准[3]，其中男21例，女6例；年龄1～36月；同时入选同期住院治疗的28例非重症肺炎患儿，其中男24例，女4例；年龄1～48月。重症肺炎组与非重症肺炎组均排除近两周使用免疫调节药物及其他先天性免疫缺陷疾病史，且均无心、脑及肝肾等重要器官疾病。另选同期儿保门诊经体检为健康正常小儿20例为健康对照组，三组性别、年龄资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1标本采集抽取1～2 ml空腹静脉血，EDTA抗凝，颠倒混匀。

1.2.2主要仪器与试剂FACS-Canto II(美国BD公司)；六色TBNK检测试剂盒(美国BD公司)[Percp-cy5.5-CD45、FITC-CD3、Apc-cy7-CD4、Pe-cy7-CD8、Pe-CD16+56、Apc-CD19]；溶血素(美国BD公司)；PBS(磷酸盐缓冲液)。

1.2.3流式细胞术检测取100 μl新鲜抗凝全血，加入含20 μl抗体的BD上样管中，震荡混匀，室温避光孵育15 min，加入800 μl 1×的免洗溶血素溶血，样本溶血充分后待上机。运行FACSDIVA软件，调节电压和荧光补偿在最佳状态，上样并分析。

2结果

2.1三组研究对象T淋巴细胞亚群水平应用流式细胞术检测了对照组(Health comparison，HC组)、非重症肺炎组(Non-severe pneumonia，NSP组)和重症肺炎组(Severe pneumonia，SP组)的淋巴细胞各亚群(见图1)。SP组CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T显著低于HC组(P<0.01，P<0.05，P<0.01)，而CD4/CD8比值明显高于HC组(P<0.05)，见表1和图2A～D。与NSP组相比，SP组CD3+T、CD3+CD8+T细胞比例显著下降(P<0.01)，见表1和图2A、C。NSP组CD3+T、CD3+CD4+T细胞水平低于HC组，差异无统计学意义(P>0.05)，但NSP组CD3+CD8+T细胞水平明显低于HC组(P<0.01)，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1和图2A～C。

图1　流式细胞术检测重症肺炎、非重症肺炎及健康对照组外周血中CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD19+B、CD16+56+NK 细胞Fig.1　Flow cytometry analysis of frequency of peripheral blood CD3+T,CD3+CD4+T,CD3+CD8+T,CD19+B,CD16+56+NK cells in HC,NSP and SP groups

GroupsnCD3+CD3+CD4+CD3+CD8+CD19+BNKCD4/CD8HCgroup2070.18±4.3040.66±4.5330.40±3.3610.14±2.4210.32±2.311.49±0.31NSPgroup2864.41±8.9636.43±8.8924.26±6.391)25.31±8.771)7.04±6.481.72±0.90SPgroup2752.14±15.511)3)31.52±13.532)18.20±6.691)3)35.94±16.541)3)6.54±6.742)2.06±1.232)

Note：Compared with HC，1)P<0.01，2)P<0.05；compared with NSP，3)P<0.01.

图2　HC、NSP和SP组CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD19+B、CD16+56+NK细胞及CD4/CD8比值的比较Fig.2　Comparison of percentage of CD3+T,CD3+CD4+T,CD3+CD8+T,CD19+B,CD16+56+NK cells and CD4/CD8 among HC,NSP and SP groupsNote: A.The comparison of the percentage of CD3+T cells;B.The comparison of the percentage of CD3+CD4+T cells;C.The comparison of the percentage of CD3+CD8+T cells;D.The comparison of CD4/CD8;E.The comparison of the percentage of CD19+B cells;F.The comparison of the percentage of CD16+56+NK cells.

2.2三组研究对象CD19+B、NK细胞的水平NSP和SP组CD19+B细胞水平显著高于HC组(P<0.01)，且SP组明显高于NSP组(P<0.01)，见表1和图2E。SP组与NSP组比较NK细胞水平差异无统计学意义(P>0.05)，但与HC组相比，SP组NK细胞水平显著降低(P<0.05)，见表1和图2F。

3讨论

目前研究指出，婴幼儿肺炎的发病机制不仅与病原体直接侵害有关，与机体免疫功能尚有密切联系，婴幼儿的免疫系统发育不完善，抵御外界致病原入侵的能力较弱，这为外界病原菌如支原体、病毒、细菌的直接入侵创造了有利条件，入侵的病原菌可进一步破坏患者体内的T淋巴细胞平衡[4]，损害机体免疫功能。人体外周血中淋巴细胞亚群主要包括了T淋巴细胞、B淋巴细胞及NK细胞，它们相互协调、制约，共同维持机体免疫稳态，一旦机体受到外界病原菌感染导致免疫系统失调时，各淋巴细胞亚群的数量及功能均会发生异常，以致免疫功能降低从而引起疾病的发生与发展。T淋巴细胞是反映机体免疫功能的重要指标，具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞、辅助B细胞体液免疫及分泌细胞因子间接作用于靶细胞，维持机体免疫平衡的重要意义。CD3+T淋巴细胞代表了所有的成熟T细胞及机体细胞免疫的基础，根据表面CD分子表达不同分为CD3+CD4+T和CD3+CD8+T淋巴细胞，CD3+CD4+T细胞为辅助性T细胞，可通过释放多种因子激活B细胞和效应T细胞来上调机体的免疫功能[5,6]，CD4+T淋巴细胞的减少会使人体逐渐丧失对抗原的免疫反应。有学者指出，CD4+T淋巴细胞肺内发挥尤其重要的功能。研究报道，在感染的肺组织中，CD4+T淋巴细胞可提高吞噬细胞活性，加强B细胞反应，并促进CD8+T淋巴细胞扩增，对保持CD8+T淋巴细胞监控和杀伤功能有重要作用[7]。而CD3+CD8+T细胞即为抑制性/细胞毒性T淋巴细胞具有抑制机体免疫应答或细胞毒的功能[8]。正常情况下，CD4+T细胞与CD8+T细胞相互制约，以产生适度的免疫应答，使之既能清除异物又不致损伤机体自身组织，处于动态平衡的状态，以维持机体免疫功能的稳定[9]。本研究结果显示，无论是重症肺炎还是非重症肺炎患儿体内的CD3+T、CD3+CD4+T淋巴细胞水平均出现了不同程度的降低，这与国内学者研究结果趋势一致[10,11]。与健康对照组比较，重症肺炎组CD3+T、CD3+CD4+T及CD3+CD8+T下降显著(P<0.01、P<0.05、P<0.01)，以CD3+CD8+T细胞减少尤为突出，三组间相互比较均有显著差异(P<0.01)。重症肺炎患儿CD3+T、 CD3+CD4+T、CD3+CD8+T细胞显著下降说明机体T淋巴细胞的功能有整体受到抑制的可能，CD4+辅助性T细胞促进细胞免疫及体液免疫的作用减弱，尤其CD8+抑制性T细胞的抑制免疫细胞的增殖与分化的功能亦被削弱得更加明显。与重症肺炎不同的是，非重症肺炎与健康对照组比较CD3+T、 CD3+CD4+T减少并不明显，而CD3+CD8+T细胞比例已显著下降，提示非重症肺炎患儿T细胞的抑制和细胞毒功能已有明显减弱的可能，从而造成机体未能及时有效地清除带有致病原的细胞，给致病原的传播创造了有利条件，间接引起病情恶化。

本次研究观察到重症肺炎组CD4/CD8比值较健康对照显著升高，这与Zhu等[12]的研究结果不同，Zhu等研究指出支气管肺炎患儿的CD4/CD8比值与对照组比较差异无统计学意义，分析之所以结果出现差异与两次研究患儿入选组别标准不尽相同有关，本研究患儿的分组依据按照2005年中华医学会儿科学分会《2005年全国小儿社区获得性呼吸道感染专题研讨会纪要》、《医院获得性肺炎诊断和治疗指南》中的诊断标准[3]，而Zhu等患儿分组依据按WHO肺炎及重症肺炎的诊断标准[13]，这可能引起两次研究入选同一组别的患儿病情程度却不一致，从而出现不同研究结果。

本研究结果发现肺炎组与重症肺炎组较对照组CD19+B淋巴细胞比例均显著上升，且重症肺炎组显著高于肺炎组。提示患儿有B淋巴细胞活化，产生抗体的能力增强，介导体液免疫抵御外界病原菌的可能。但由于大多数B淋巴细胞在抗原刺激后，需在CD4+T细胞的辅助下，产生抗体，发挥体液免疫的作用，本组资料显示重症肺炎组CD4+T辅助性细胞明显减少，显然存在不能给B淋巴细胞提供足够的辅助功能的可能性，再加上婴幼儿免疫系统尚未发育完善，呼吸道局部免疫功能不足，肺泡巨噬细胞杀菌和吞噬能力低下，婴幼儿呼吸道分泌的溶菌酶、乳铁蛋白、补体、干扰素等与抵抗病原微生物的物质含量低，且B淋巴细胞也未完全成熟，机体有时并不能产生特异性抗体[14]。所以虽然重症肺炎组患儿B淋巴细胞比例上升，但生成抗体及发挥体液免疫功能并不一定增强。

NK细胞称为自然杀伤细胞，是机体固有免疫的一部分，可直接杀伤病原体或被感染靶细胞，也可通过分泌γ干扰素(IFN-γ)来调节机体的免疫功能，促进Th1型免疫反应[15]。本研究结果中重症及非重症肺炎组NK细胞水平较健康对照组均下降，但唯有重症肺炎组与健康对照组NK细胞水平比较差异有统计学意义(P<0.05)，这提示重症肺炎患儿NK细胞免疫功能有受损更为严重的可能。

综上所述，重症肺炎及非重症肺炎患儿的免疫功能都受到了不同程度损害。CD19+B细胞比例与疾病严重程度呈负相关的趋势，而CD3+CD8+T细胞比例与疾病严重程度呈正相关趋势，CD3+CD8+T、CD19+B淋巴细胞水平能否成为临床判断疾病严重程度参考指标，尚有待进一步研究。同时，本次研究提示重症肺炎患儿细胞免疫功能存在受损更为严重的可能性，其T细胞总数及各亚群水平均显著下降，识别和杀伤致病菌能力被削弱，有利于致病菌进一步扩散繁衍而加重疾病进展，这提示在临床治疗方面，除了应用相应抗生素进行治疗，也要注重的应用免疫调节剂，可能对防止并发症、提高疗效、缩短病程有重要意义。同时我们也注意到本次研究存在样本量较少和未能涉及CD19+B细胞亚群检测的局限性，需要未来更多的研究去填补这一局限。

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[收稿2015-06-03修回2015-07-23]

(编辑张晓舟)

Analysis difference of lymphocyte subgroups between children with severe pneumonia and non-severe pneumonia

LONGSi-Qi,MALi,CHENMin,LIHong.

CentralLaboratory,AffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China

[Abstract]Objective:To observe the levels of lymphocyte subgroups in children with severe pneumonia and non-severe pneumonia,and to investigate the change of celluer immune funciton of patients,moreover provide available reference for treatment.Methods: Flow cytometry instrument was used to detect peripheral blood CD3+T,CD3+CD4+T,CD3+CD8+T,CD19+B lymphocytes and NK cells in 27 children with severe pneumonia and 28 children with non-severe pneumonia.In addition 20 heathy children were selected as the controls.Results: Compared with the heathy control group,the levels of CD3+T,CD3+CD4+T,CD3+CD8+T lymphocytes and NK cells in children with severe pneumonia decreased significantly(P<0.01,P<0.05,P<0.01,P<0.05),while CD4/CD8 ratio,CD19+B cells were significantly increased(P<0.05,P<0.01).The level of CD3+CD8+T lymphocytes in children with non-severe pneumonia significantly lower than the heathy control group(P<0.01),but the level of CD19+B cells in children with non-severe pneumonia significantly higher than the heathy control group(P<0.01).Compared with non-severe pneumonia group.The levels of CD3+and CD3+CD8+T lymphocytes in children with severe pneumonia decreased significantly(P<0.01),however CD19+B cells were significantly increased(P<0.01).Conclusion: Immune dysfunction exists in both of children with severe pneumonia and non-severe pneumonia.Children with severe pneumonia has more serious damage in inmmunity.This provides certain theoretical basis for clinical evaluation and treatment.

[Key words]Severe pneumonia；T lymphocytes subsets；CD19+B lymphocytes ；Cellur immunity

中图分类号R563.1

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)03-0401-04

作者简介：龙思琪(1988年-)，女，在读硕士，检验技师，主要从事儿童免疫功能缺陷及流式细胞术临床应用的研究，E-mail:longsiqi330@163.com。通讯作者及指导教师：马莉(1962年-)，女，教授，主任技师，硕士生导师，主要从事儿童免疫功能缺陷及自身免疫性疾病的研究，E-mail:18608505639@163.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.023

①本文为贵州省卫生厅科学技术基金项目(No.gzwkj2013-1-016)。

②贵州省贵阳市儿童医院，贵阳550004。