王士勇

（黑龙江省巴彦县畜牧兽医局，黑龙江巴彦 151800）

应用核型分析法鉴定家畜胚胎性别

王士勇

（黑龙江省巴彦县畜牧兽医局，黑龙江巴彦 151800）

核型分析是根据动物染色体着丝点位置、臂比、染色体长度、随体的有无等特征，并借助染色体分带技术对某一生物的染色体进行比较、分析、排序和编号。其分析以体细胞分裂中期染色体为研究对象。染色体组型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间关系所不可缺少的重要手段。

家畜；胚胎；核型分析法；鉴定

1 鉴别原理

不同物种的染色体都有各自特定的形态结构，包括染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体大小等特征，而且这种形态特征是相对稳定的。经行核型分析后，可以根据染色体结构和数目的变异来判断生物的病因，比如是由于缺少了什么样的基因才导致的这种疾病。以动物胚胎性别鉴定为目的的核型分析常一般采用切割胚（晚期桑葚胚、囊胚或扩张囊胚），一半用于鉴定性别，另一半用于移植或冷冻。如果目的是为了扩张囊胚，切割时可切成含内细胞团的半胚和含滋养层细胞的半胚，前者用于冷冻、移植，后者用于核型分析。

2 分割胚胎

在牛，以非手术法采集7日龄胚胎，选择活力强、发育正常的胚胎以备切割。用2%链霉蛋白酶处理1分钟以脆化透明带，在显微操作仪下切割胚胎。其中一半装人透明带，在37℃、5%二氧化碳条件下培养以备移植，或用牛的血清琼脂包埋以便冷冻。另一半亦装入透明带，用于核型分析。

3 半胚预培养及有丝分裂阻滞

拟作核型分析的半胚在含20%灭活FCS的M199培养液中培养15h（用培养皿或96孔板培养）。预培养时间与半胚性别鉴定率显著相关。预培养2h、6h和15h，对半胚的性别鉴定率分别为25%、81%和95%。

预培养结束后，加入有丝分裂阻断剂继续培养，使有丝分裂停止在分裂中期。常用的分裂阻断剂有秋水仙素、去甲秋水仙素、长春花碱或硫酸长春花碱与鬼臼毒素（V-P）。分裂阻断剂的浓度和处理时间对分裂相的产生和染色体分散程度关系极大。如果浓度不够或处理时间过短，则标本中分裂相少；如浓度过高或处理时间过长，虽然标本中分裂相多，但其染色体收缩得太短，难于计数和分析。各种阻断剂有其独自的最适浓度和处理时间。因此，在预实验中应根据实验室条件和所用培养液，对分裂阻断剂的浓度和作用时间进行比较，以便获得既有足够的分裂中期相，又有长度适合的染色体。

在对牛体外受精的2细胞胚进行核形分析时发现，V-P优于去甲秋水仙素。当在M199中加入0.08μg/mlV-P或0.04μg/ml去甲水仙素阻断分裂时，核型分析率分别为69.1%和42.9%。他进一步比较了用0.08μg/mlV-P处理胚胎的时间对核型分析率的影响，在处理4h、8h和12h以后，核型分析率分别为50.0%、81.5%和100%。据此认为，以0.08μg/mlV-P处理12h为更为合适。然而，有关科研人员在对切割后的早期桑葚胚和囊胚进行性别鉴定时发现，去甲秋水仙素优于长春花碱，其半胚性别鉴定率分别为87%和46%。其处理条件是在培养液中含0.04μg/ml去甲秋水仙素，处理4h。科研人员用小鼠扩张囊胚比较了秋水仙素在不同培养液中的作用。将秋水仙素以0.4μg/ml的浓度，分别溶解于BMOC-3、MEM+20%FCS和PBS+20%FCS中分裂阻滞处理2h，其每枚胚胎中期分裂相分别为2.2～10.6、0.3～7.3和-0.1～6.9，故认为BMOC-3是秋水仙素理想的培养液。他还比较了不同秋水仙素浓度、不同作用时间对核型分析的影响，发现随培养时间的增加，中期分裂相增加，但由于细胞退化而使细胞核反而减少。故建议小鼠胚胎以每1mlBMOC-3中含0.4μg秋水仙素、培养2h为宜。但将此法用于牛胚胎核型分析时，中期分裂相获得率为81.0%（34/32），性别鉴定率仅为38.2%（13/42）。看来不同的动物也许有各自的最佳条件。

4 染色体标本制作

将经分裂阻断剂处理后的半胚移入0.88%或0.9%的柠檬酸钠溶液中处理7min，使细胞膨胀、染色体分开，然后将该半胚移到干净无油脂载玻片的一个低渗小滴中，再加第一固定液（甲醇：醋酸：无离子水＝3：2：1）固定处理1min，最后将第二固定液（醋酸）直接加到半胚上，溶解透明带，使胚细胞分散，37℃风干1min。

5 染色及镜检

风干后的标本以pH 7.0左右的PBS配制的10%吉姆萨染色液染色，晾干后直接用中性树胶封固成永久性标本。也可将玻片标本先经二甲苯透明后再封固。染色体标本在100倍显微镜下检查。各种家畜的染色体数目（常染色体加性染色体）有所不同，性染色体的形态亦各有特点。牛、马、绵羊、山羊和猪的染色体总数分别为60、64、54、60和38，其中均含有一对性染色体（XX或XY）。一般X染色体较大，Y染色体很小。各种家畜性染色体的特征描述如下。

对于家牛，X染色体特征：大，亚中部着丝粒大；Y染色体特征：小，中部着丝粒。对于瘤牛，X染色体特征：大，亚中部着丝粒；Y染色体特征：小，亚端部着丝粒。对于山羊，X染色体特征：大，亚端部着丝粒（具有微小短臂）；Y染色体特征：微小，中部着丝粒。对于猪，X染色体特征：中等大小，中部着丝粒；Y染色体特征：小，中部着丝粒。对于绵羊，X染色体特征：大，亚端部着丝粒；Y染色体特征：微小，中部着丝粒。对于马，中等大小，亚中部着丝粒；Y染色体特征：小，亚端部着丝粒。

核型分析是一项很细致的研究工作，在进行性别判定时，应严格依据各种家畜性染色体的特征认真观察比较各种动物（特别是家畜肋动物，如牛、绵羊、猪、家兔等）的染色体特征，可供胚胎性别鉴定时参考。

[1]田万强，魏红芳，昝林森.家畜早期胚胎性别鉴定方法在畜牧业中的应用[J].黄牛杂志，2001，27（5）：43-46.

王士勇（1971—），男，黑龙江巴彦县人，本科，高级畜牧师，主要从事畜牧工作。