汤南,万洁,陈博,张媛,陈鸿鹏

(1广东医科大学药学院，广东东莞 523808； 2广东医科大学基础学院；3暨南大学附属第一医院；4广东医科大学信息工程学院)



·基础研究·

紫杉醇、多西紫杉醇对大鼠肝细胞株BRL-3A细胞缝隙连接功能的影响

汤南1,万洁2,陈博2,张媛3,陈鸿鹏4

(1广东医科大学药学院，广东东莞 523808； 2广东医科大学基础学院；3暨南大学附属第一医院；4广东医科大学信息工程学院)

目的观察紫杉醇、多西紫杉醇对大鼠肝细胞株BRL-3A细胞缝隙连接(GJ)功能的影响。方法采用磺酰罗丹明B比色法筛选紫杉醇和多西紫杉醇不影响BRL-3A细胞生长的作用浓度。采用细胞接种荧光示踪法与划痕标记染料示踪技术检测紫杉醇与多西紫杉醇作用BRL-3A后细胞GJ功能。结果筛选出的紫杉醇、多西紫杉醇药物浓度均为0.01、0.1、0.5、1.0 μmol/L。与溶剂对照组相比，0.01、0.1、0.5、1.0 μmol/L紫杉醇处理的BRL-3A细胞Calcein荧光传递率降低(P均<0.05)，多西紫杉醇处理的BRL-3A细胞Calcein荧光传递率无明显变化。与溶剂对照组相比，紫杉醇作用细胞后LY向邻近细胞传递距离缩短，多西紫杉醇作用细胞后LY向邻近细胞传递距离无明显变化。结论紫杉醇可显著抑制大鼠肝细胞株BRL-3A细胞GJ功能，而多西紫杉醇则不影响GJ功能。

紫杉醇；多西紫杉醇；细胞缝隙链接；肝细胞株；BRL-3A细胞

细胞缝隙连接(GJ)是相邻细胞间进行直接信号与物质交流的膜通道，由连接蛋白(Cx)组成。6个Cx亚单位环行排列组成一个“连接子”，其中心形成一个孔道[1]。相邻细胞膜上的两个“连接子”对接后组装为一个GJ通道，分子量﹤1～2 kDa的小分子或第二信使等物质可通过GJ在毗邻细胞间扩散、传递和转运[2]。GJ所介导的细胞间直接接触的通信方式是细胞生物学行为的重要调控形式，在细胞的新陈代谢、增殖分化、维持内环境稳定等生理过程中发挥重要作用。紫杉烷类抗肿瘤药物——紫杉醇与多西紫杉醇是目前临床上广泛使用的一类广谱化疗药，对乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌及非小细胞肺癌等有较好的疗效。但作为细胞毒类抗肿瘤药，它们在杀伤癌细胞的同时，对机体正常细胞及组织器官也有一定的损害，其中对肝脏的损伤引起研究人员越来越多的关注[3～6]。肝细胞中分布较多的GJ，观察紫杉醇与多西紫杉醇对肝细胞GJ连接功能的影响，可为紫杉烷类抗肿瘤药物肝损伤的研究提供参考。

1　材料与方法

1.1试剂、仪器及细胞株紫杉醇与多西紫杉醇(Sigma-Aldrich公司)；Calcein-AM及CM DiI(Invitrogen公司)；荧光黄(LY，Sigma-Aldrich公司)；DMEM高糖培养基，新生牛血清，0.25%胰酶和青-链霉素(Gibco公司)；其他试剂均为常用分析纯。酶标仪(美国BioTek公司)，IX51荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)。实验所用大鼠肝细胞株BRL-3A购自ATCC。

1.2紫杉醇、多西紫杉醇给予方法及其对BRL-3A细胞GJ功能的影响采用磺酰罗丹明B比色法(SRB法)对紫杉醇、多西紫杉醇的剂量(不引起细胞毒性)进行筛选，确定合适药物浓度均为0.01、0.1、0.5、1.0 μmol/L。采用以下两种方法观察紫杉醇、多西紫杉醇对BRL-3A细胞GJ功能的影响。①细胞接种荧光示踪法：将BRL-3A细胞接种于12孔板，待细胞生长融合后，分别加入0.01、0.1、0.5、1.0 μmol/L的紫杉醇和0.01、0.1、0.5、1.0 μmol/L多西紫杉醇作用1 h，同时设立溶剂对照组(采用溶剂处理BRL-3A细胞)。取其中一孔空白细胞加入荧光指示剂Calcein-AM孵育30 min，作为“供体细胞”。胰酶消化收集荧光标记好的“供体细胞”，接种到已生长融合的其他孔BRL-3A细胞(“接受细胞”)上,培养4 h。用荧光显微镜计数1个“供体细胞”周围含有Calcein的“接受细胞”数，与溶剂对照组比较，计算Calcein荧光传递率。②划痕标记染料示踪技术：将BRL-3A细胞接种于6孔板，待细胞生长融合后，加入1.0 μmol/L的紫杉醇和1.0 μmol/L的多西紫杉醇作用1 h，同时设立溶剂对照组(采用溶剂处理BRL-3A细胞)，吸去6孔板中的培养液，PBS洗3次，每孔加入300 μL 0.5% LY，用手术刀片迅速做一划痕，将6孔板避光孵育3 min，PBS洗3次后荧光显微镜下观察LY的传输距离。

2　结果

与溶剂对照组相比，0.01、0.1、0.5、1.0 μmol/L紫杉醇处理的BRL-3A细胞Calcein荧光传递率降低(P均<0.05)，分别为82.48%±4.75%、80.20%±5.09%、78.90%±7.74%和73.75%±9.85%。与溶剂对照组相比，0.01、0.1、0.5、1.0 μmol/L多西紫杉醇处理的BRL-3A细胞Calcein荧光传递率分别为100.67%±1.00%、102.35%±3.93%、96.40%±6.60%、94.12%±10.51%。与溶剂对照组相比，紫杉醇作用细胞后LY向邻近细胞传递距离缩短(约4层)，多西紫杉醇作用细胞后LY向邻近细胞传递距离无明显变化(约7层)。

3　讨论

抗肿瘤药物所致肝损伤在所有药物性肝损伤中占很大比重。紫杉醇和多西紫杉醇是目前公认的对多种肿瘤具有确切疗效的广谱化疗药物，肝脏是二者代谢的主要脏器，该类药物导致的肝损伤将不可避免地直接干扰其体内代谢过程，从而影响疗效发挥。目前，关于紫杉醇和多西紫杉醇引起肝损伤的机制研究仅有较少的报道，主要认为是与ROS自由基等有害物质引起的氧化应激反应有关[7,8]。

GJ是相邻细胞间形成的一种可以开放和关闭的膜通道结构，GJ通信是生物体内细胞之间直接的信息交流，小分子物质及某些信号分子可以通过GJ在细胞间传递。GJ广泛存在于实质性脏器组织(如肝脏、心脏、肾脏、肺等)中。组成GJ的Cx目前在哺乳动物中发现有21种[1]，Cx依据其分子量进行命名。不同Cx组成的GJ通道对物质和信号的传递具有选择通透性。ATP和谷氨酸易于通过Cx43通道，而三磷酸肌醇和腺苷则易通过Cx32通道[9～11]。这种选择通透性与GJ调节的生理功能有关，GJ通道功能改变将影响细胞之间的正常通信，从而导致疾病发生。研究[12～14]证实GJ异常与肿瘤、血栓、癫痫等多种疾病的发生有关。在大多数肿瘤的形成阶段常伴随着GJ功能的降低或消失，改善或恢复肿瘤细胞的GJ功能可增强顺铂、奥沙利铂等抗肿瘤药物的细胞毒性[15]。这可能与GJ介导的“损伤信号”传递有关。

肝细胞中富含Cx32组成的GJ[16～18]，由于GJ在物质和信号传递中的重要调节作用，近年来GJ与药物性肝损伤的关系引起研究人员的关注。本研究发现，在不引起细胞毒性的条件下，紫杉醇抑制肝细胞的GJ功能，而多西紫杉醇对此GJ功能则无明显影响。两药显示出的不同作用，将可能体现出信号分子在肝细胞间传递的差异性，这为二者肝损伤的研究提供了新的方向。

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国家自然科学基金资助项目(81400619)；广东省医学科研基金资助项目(A2014472，A2013428)。

陈鸿鹏(E-mail： chenhpgdmc@foxmail.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.23.009

R73

A

1002-266X(2016)23-0031-03

2015-11-26)