张颖/天津市动物疫病预防控制中心

副猪嗜血杆菌病诊断研究进展

张颖/天津市动物疫病预防控制中心

副猪嗜血杆菌病又称革拉泽氏病，是由副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，Hps）引起的猪的呼吸道传染病，主要感染断奶前后仔猪，引起猪多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎，已严重影响养猪业的发展，因此早期诊断有助于控制好该病。

一、病原学检测

根据临床症状、剖检病变进行细菌分离鉴定是副猪嗜血杆菌病的经典诊断方法。然而该菌培养条件苛刻，生长过程需要额外的NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）。但往往在实际操作中发现，很难从患病动物中分离到HPS，尤其是经抗生素治疗后，其分离更加复杂。

二、血清学检测

用于检测副猪嗜血杆菌抗体的方法由补体结合试验（CF）、间接血凝试验（IHA）和酶联免疫吸附试验（ELISA）。

1.补体结合试验（CF）。过去国外以补体结合试验为主，在急性病例的临床经过开始后大约1周出现循环CF抗体。Takahashi等采用补体结合试验检测二次免疫后19 d后阳性抗体滴度，但该实验并未检测不同血清型之间的交叉反应。由于补体结合试验参与反应的成分多，影响因素复杂，操作因素复杂，已被其他方法取代。

2.间接血凝试验（IHA）。将可溶性抗原吸附于一种与免疫无关且有一定大小的不溶性颗粒的表面，在有电解质存在的适宜条件下，与相应的抗体发生特异性凝集。魏子贡等将血清型4、5型分离菌株经超声波破碎处理后的产物致敏醛化红细胞，建立HPS间接血凝试验，其敏感性为琼脂扩散试验的16倍，对1 665份猪血清进行检测，阳性率47.1%。

3.酶联免疫吸附试验（ELISA）。

ELISA方法是目前实验室诊断中常用的方法，具有灵敏度高、稳定、操作简便等优点。建立该方法所选择的抗原由荚膜多糖、灭活全菌体、超声破碎抗原等。王艳等以副猪嗜血杆菌全菌体浓度为2.24×107CFU/孔作为包被抗原，建立了副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法，经检测，14个发病猪场的100份血清抗体阳性率94%，明显高于细菌分离鉴定结果。石碧等以该菌血清5型菌株的荚膜多糖作为抗原分别建立了间接血凝试验（IHA）和间接ELISA两种抗体检测方法，其特异性良好，但ELISA敏感性是IHA的5～10倍。对320份临床样本进行检测，IHA和ELISA阳性率分别40%和59%。刘娜等提取该菌的超声波破碎抗原、全菌抗原作为包被抗原建立的两种间接ELISA方法，对四川省和重庆市的4个猪场的162份血清进行检测，并用间接血凝试验作为对照，结果显示，包被全菌抗原、超声波破碎抗原建立的间接ELISA方法相对于间接血凝方法的符合率分别为98.15%和97.53%。冯小明等采用超声裂解的副猪嗜血杆菌血清5型分离株菌体上清作为包被抗原，对其反应条件进行优化，建立间接ELISA方法，并对浙江地区6个猪场的200份血清进行检测，以间接血凝作比对，其阳性率分别为21%、15%，敏感性明显高于间接血凝试验。马福利等采用超声裂解副猪嗜血杆菌分离株5型菌体上清作为包被抗原，初步建立副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA检测方法。与商品化ELISA试剂盒进行比对，检测结果基本一致。然而血清学检测只能作为猪群是否感染过副猪嗜血杆菌的诊断依据，而不能作为诊断该病的依据，在临床诊断中，除了观察猪群临床症状、病理变化，还需借助分子生物学技术进行确诊。

三、分子生物学技术

随着分子生物学研究的不断深入，PCR诊断技术已广泛用于各个领域。尹秀凤等建立了快速、简便、准确的PCR方法，扩增片段大小为822 bp，最小检测量为1 080个Hps。与大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和链球菌无特异性反应。经检测，发现肺脏检出率最高。张盼锋等针对副猪嗜血杆菌16 s rRNA基因特异性PCR引物序列，合成一对PCR引物，建立相应的PCR检测方法，结果显示可检测出浓度为2.8×103CFU/mL。万世平等根据副猪嗜血杆菌16 s rRNA基因设计了一对引物， 通过最佳条件摸索，扩增出大小为821 bp的特异目的基因片段， 建立了快速检测副猪嗜血杆菌的PCR方法。该方法最低检出量达10-3ng， 且对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌和巴氏杆菌等均无交叉反应。但常规PCR只能定性，而不能定量起始DNA模板的拷贝数，随着荧光定量PCR技术的快速发展，该技术广泛用于用于疾病的检测。该技术灵敏度比普通PCR提高100倍，并能减少假阳性发生的几率，并且由于不用电泳减少了污染、节省了时间、使检测结果更为直观。于江等根据infB基因序列建立基于SYBR Green I荧光定量PCR检测方法，结果表明，该方法特异性强，稳定性高，批间与批内重复试验变异系数均小于2.5%。李军等根据16 s rRNA基因序列，建立快速定量检测副猪嗜血杆菌的实时荧光PCR方法，结果表明，该方法最低检测限为50拷贝/uL，特异性、重复性好，变异系数均小于2%。罗宝玉等根据转录起始因子infB基因序列，建立TaqMan探针荧光PCR技术，检测结果显示，其灵敏度达1 ul 1.0×101拷贝的数量级，在对送检的56份猪肉和12份血浆蛋白粉样品进行检测中显示，该方法与细菌分离方法效果一致。

四、环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术最早是由日本学者Notomi于2000年提出的新的基因诊断技术，目前已有一些病原微生物成功利用LAMP检测，该方法灵敏度高，反应时间短，无需特殊仪器，操作简单，特别适合基层人员操作。朱杰仪等人根据GenBank上发表的不同血清型Hps的16S rRNA序列，针对其保守区域设计4条特异性引物，建立Hps环介导等温扩增法，实验表明，该方法在恒温63℃条件下特异性强，敏感性是PCR的100倍。魏晓媛以OMP P2基因序列建立环介导等温扩增方法进行检测，结果显示，LAMP最低检测DNA量为0.2 pg/ uL。车勇良等根据副猪嗜血杆菌肽聚糖相关脂蛋白（PalA）基因序列建立该菌的可视化LAMP检测方法，实验表明，该方法在55℃水浴1h可高效扩增，反应结束后加入SYBR Green I可通过肉眼观察结果，其对DNA核酸的最低检测限为40fg，是常规PCR检测最低限的100倍。但在实际操作中，由于其灵敏度高，以致开盖后容易造成气溶胶污染而出现假阳性的结果。随着分子生物学的发展，相信一些新型诊断方法会不断问世以推广应用，使人们能更快速、准确地诊断副猪嗜血杆菌病。

（略）