张齐梅，周 骢，伍宝琴，聂敏海

（西南医科大学附属口腔医院牙周黏膜科，四川泸州 646000）

槲皮素对口腔鳞状细胞癌ISG15表达及细胞迁移侵袭影响*

张齐梅，周 骢，伍宝琴，聂敏海

（西南医科大学附属口腔医院牙周黏膜科，四川泸州 646000）

目的：探讨槲皮素对人口腔鳞状细胞癌SCC-15细胞株中干扰素刺激基因15（interferon stimulated gene 15，ISG15）的表达及细胞迁移侵袭能力的影响。方法：培养人口腔鳞状细胞癌SCC-15细胞株，槲皮素干预后，Western blotting法检测ISG15蛋白表达水平，划痕法检测细胞迁移，Transwell法检测细胞侵袭能力。结果：槲皮素干预人口腔鳞癌SCC-15细胞株24 h后，ISG15蛋白表达、细胞迁移及侵袭能力均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：槲皮素干预后能够降低人口腔鳞癌SCC-15细胞株ISG15表达，抑制细胞迁移、侵袭能力。

口腔鳞状细胞癌；槲皮素；干扰素刺激基因15

口腔鳞状细胞癌 （oral squamous cell carcinomas，OSCC）属于人类头颈部常见的恶性肿瘤之一，具有发病率高、死亡率高、存活率低等特点[1]。目前对OSCC发病机制研究仍不清楚，其治疗效果也不理想。在众多机制中，泛素-蛋白酶体通路（ubiquitin proteasome pathway,UPP）可能具有重要作用。有研究指出由于UPP具有降解细胞内蛋白质的作用，因此UPP可能参与了OSCC的发生发展过程[2]。干扰素刺激基因15（interferon stimulated gene 15，ISG15）是由I型干扰素诱导后高表达的小分子量蛋白质，是UPP通路上游调节因子，目前已发现ISG15在众多肿瘤中高表达。 UPP与ISG15在肿瘤中的表达差异可能与肿瘤发展有关，比如在前列腺癌中，ISG15表达增加而泛素化蛋白相应减少[3]，但ISG15在口腔鳞状细胞癌中表达尚不清楚，因此研究ISG15在OSCC中的表达具有重要意义。槲皮素（quercetin，Que）作为一种具有抗炎 、免疫调节及抗肿瘤的黄酮类化合物，可能对OSCC具有一定抑制作用，但目前研究较少[4]。因此本文旨在通过检测槲皮素干预对人口腔鳞癌SCC-15细胞株中ISG15的蛋白表达以及细胞运动侵袭能力改变，探讨槲皮素对OSCC的治疗效果和机制影响。

1 材料与方法

1.1 材料

槲皮素（Sigma公司，纯度98%，溶于DMSO中，终浓度低于1‰）；兔抗人β-actin、ISG15多克隆抗体，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体（Abcam公司）。人口腔鳞状癌SCC-15细胞株（购自上海拜力生物有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 ISG15蛋白提取及检测

SCC-15（oral squamous cell carcinoma）细胞株采用含L-谷氨酸和10%FBS的DMEM培养液培养，每隔3~5 d传代1次。将细胞分为SCC-15组与槲皮素组，细胞传代后待细胞铺满瓶底，SCC-15组仅给予培养基，槲皮素依据前期预实验结果与相关文献，选择100 μmol/L作为干预浓度，因此槲皮素组给予槲皮素100 μmol/L，干预时间为24 h[5]。24 h后将细胞用胰酶消化后收集，之后加入预冷的RIPA裂解液 （50 mM Tris-base,1 mM EDTA,150 mM NaCl,0.1%SDS,1%TritonX-100,1%Sodium deoxycholate）600 μl，冰上裂解50 min，4℃、12 000 r/ min离心5 min，用BCA法测蛋白浓度。上样量为40 μg，经SDS-PAGE电泳分离后，100 V恒压转膜，50 g/L脱脂牛奶室温封闭1 h，加入适当浓度一抗（ISG15 1∶800，β-actin 1∶2 000），冰箱4度孵育过夜，之后PBST漂洗15 min×3次，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（羊抗兔1∶1 000），室温孵育1 h，PBST漂洗15 min×3次。化学试剂发光，曝光并采集图像，Image Lab软件3.0版分析目的蛋白条带的灰度值与内参条带的灰度值，取三次试验平均值作为统计数据进行统计学比较。

1.2.2 细胞迁移实验

将细胞分为SCC-15组与槲皮素组，采用划痕法观察槲皮素对SCC-15细胞迁移能力的影响。先在6孔板后划出均匀横线，胰酶消化制备单细胞悬液后将细胞按5×105/ml加入6孔板中，24 h后用枪头划痕。槲皮素组给予槲皮素100 μmol/L。24 h后拍照，image proplus 6.0软件分析，计算迁移率。迁移率=（初始边缘距离-24 h后边缘距离）/初始边缘距离。

1.2.3 细胞侵袭实验

SCC-15细胞侵袭分组同细胞迁移实验，采用BD公司的基质胶包被的侵袭小室 （growth-factor depleted Matrigel invasion chambers）观察槲皮素对SCC-15细胞侵袭能力的影响。在Matrigel chambers加入500 μl不含血清的DMEM培养基中室温放置1 h，使基质胶水化，再弃多余培养基。下室孔板内加入750 μl含20%FBS的DMEM培养基。胰酶消化并离心收集细胞，用含0.1%BSA的DMEM重悬细胞至4×105/ml，取200 μl加入上室。槲皮素组给予槲皮素100 μmol/L，干预时间为24 h。24 h后，用棉签抹去上室未能穿膜的细胞，用100%甲醇固定10 min。用0.1%结晶紫染色细胞并在显微镜下计数。

1.2.4 统计学方法

2 结果

2.1 槲皮素对SCC-15细胞株中ISG15蛋白表达影响

实验结果显示，SCC-15细胞株中ISG15蛋白表达增加，蛋白条带的灰度值与内参条带的灰度值比值为1.82±0.11。槲皮素100 μmol/L干预后，SCC-15细胞株中ISG15蛋白表达减少，蛋白条带的灰度值与内参条带的灰度值比值为1.02±0.08，与SCC-15组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

2.2 槲皮素对SCC-15细胞株迁移和侵袭能力影响

细胞迁移结果显示，24 h后SCC-15组细胞株的迁移率为（42.5±5.57）%，槲皮素100 μmol/L干预后迁移率为（11.34±1.79）%，差异有统计学意义（P＜0.01）。

细胞侵袭结果显示，SCC-15组细胞穿膜个数为（112.20±24.36）个，槲皮素100 μmol/L干预后穿膜细胞数为（28.87±6.47）个，差异有统计学意义（P＜0.01）。

实验结果提示槲皮素能显著降低人口腔鳞状细胞癌SCC-15细胞株的迁移和侵袭能力，表明槲皮素具有一定抑制人口腔鳞状细胞癌SCC-15细胞运动力。

3 讨论

ISG15结构与泛素类似，属于类泛素修饰蛋白，是一种干扰素诱导后产生的小分子量蛋白质[6]。ISG15可通过一系列酶系反应调节靶蛋白的作用，参与免疫调节及肿瘤的发生发展。目前已发现有200多种作用于ISG15的靶蛋白[7-9]。ISGl5蛋白表达差异较大，表现在不同肿瘤细胞、同一组织来源的肿瘤细胞均存在差异[10]。槲皮素及其衍生物具有包括抗肿瘤在内的多种生物学活性，具有较广的抗瘤谱，对前列腺癌等多种肿瘤具有抑制作用[11]。为研究ISG15蛋白在人口腔鳞状癌SCC-15细胞株中表达情况以及筛选针对ISG15蛋白的药物，本研究通过免疫印迹法比较ISG15蛋白在SCC-15细胞株的表达以及槲皮素干预后ISG15在OSCC中表达的差异，推测槲皮素是否通过干预ISG15蛋白表达抑制人口腔鳞癌细胞。结果显示，与100 μmol/L的槲皮素干预后比较，ISG15蛋白在人口腔鳞状癌SCC-15细胞株中表达增加，提示100 μmol/L的槲皮素能够明显抑制人口腔鳞状细胞癌 SCC-15细胞株中ISG15蛋白表达。

肿瘤细胞的转移与细胞侵袭、迁移能力有关，因此本研究还进一步检测了槲皮素对OSCC侵袭、迁移能力影响，细胞迁移实验结果显示，24 h后SCC-15组细胞株的迁移率为（42.5±5.57）%，槲皮素100 μmol/L干预后迁移率为（11.34±1.79）%，差异有统计学意义（P＜0.01）。细胞侵袭结果显示，SCC-15组细胞穿膜细胞数为（112.20±24.36）个，槲皮素100 μmol/L干预后穿膜细胞数为（28.87±6.47）个，差异有统计学意义（P＜0.01）。提示槲皮素能够抑制人口腔鳞状细胞癌SCC-15细胞运动力，表现在槲皮素能降低人口腔鳞状细胞癌SCC-15细胞株的迁移和侵袭能力。

综上所述，本研究显示槲皮素可能对口腔鳞状细胞癌有抑制作用，其机制与抑制ISG15表达，抑制口腔鳞状细胞癌的转移与细胞侵袭有关，其是否还通过其他机制干预口腔鳞状细胞癌还可进一步研究。

图1 槲皮素对SCC-15细胞株中ISG15蛋白表达影响

图2 槲皮素对SCC-15细胞株迁移能力影响

图3 槲皮素对SCC-15细胞株侵袭能力影响

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（2016-03-14收稿）

Effects of quercetin on the expression of ISG15 and the migration and invasion of oral squamous cell carcinoma

Zhang Qimei，Zhou Cong,Wu Baoqin,Nie Minhai

Department of Periodontics and Oral Medicine,the Affiliated Stomatological Hospital of Southwest Medical University,Luzhou，Sichuan Province 646000，China

ObjectiveTo investigate the effects of quercetin on the expression of ISG15 and the migration and invasion of oral squamous cell carcinoma.Methods:Oral squamous cell carcinoma cell line,SCC-15 was treated with quercetin,and the expression of ISG15 was determined by Western blotting.The invasion and migration of SCC-15 were determined by wound healing assay and transwell assay respectively.Results:After 24 hours quercetin treatment,the expression of ISG-15,and the invasion and migration of SCC-15 were decreased significantly（P＜0.05）.Conclusion:Our results show that quercetin could inhibit ISG15 expression and the invasion and migration of SCC-15 cells.

Oral squamous cell carcinomas;Quercetin;Interferon stimulated gene 15

R780.1

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.03.013

*四川省科技厅课题（2014LY-62）

张齐梅（1977-），女，主治医师，硕士。

聂敏海（1967-），男，教授。E-mail：nieminhai@126.com