郭 露，李友谊，段成霞，吕红彬

（西南医科大学附属医院眼科，四川泸州 646000）

VEGF-2578C/A基因多态性与糖尿病性视网膜病变发生风险的关系*

郭 露，李友谊，段成霞，吕红彬

（西南医科大学附属医院眼科，四川泸州 646000）

目的：研究VEGF-2578C/A基因多态性与糖尿病性视网膜病变（DR）的关系。方法：按照国际糖尿病性视网膜病变诊断标准随机选取我院门诊及住院部2型DR患者158例（DR组）、2型糖尿病患者104例（T2DM组），并随机选择门诊体检的健康个体164例作为对照组。分别抽取肘静脉血9ml，6ml送检相关指标，其余3ml用于提取全血DNA。应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性 （PCR-RFLP）法检VEGF-2578C/A基因型及基因频率，并记录糖化血红蛋白（GlyoohemoglobinA1c, HbA1c）、体重指数（Body Mass Index,BMI）、总胆固醇（Total Cholesterol,TC）、甘油三酯（Triglyceride,TG）等临床及生化指标.结果：1、DR组与T2DM组患者的BMI、HbA1c、TC和TG的指标均明显高于正常组 （P<0.05）；DR组与T2DM组HbA1c差异具有统计学意义 （P<0.05）；2、DR组与正常对照组比较：DR组CC基因型所占比例明显较正常对照组比例高，结果示CC基因型为正常人发展成为DR的危险基因（χ2=7.59,P=0.01），AA基因型为其保护基因（χ2=15.94,P=0.00）；3、T2DM组与正常对照组无明显差异 （P>0.05）；4、DR组与T2DM组比较结果示C等位基因为T2DM患者发展成为DR患者的危险基因（χ2=4.74,P=0.03），而AA基因型为其保护基因（χ2=4.07,P=0.04）。多因素Logistic回归分析结果示CC基因型、糖化血红蛋白是正常人发展为DR的危险因素。结论：DR的发生可能不仅仅与血糖相关，同时还受到了其他因素的综合影响；中国泸州地区汉族VEGF-2578C/A基因多态性与DR相关，C等位基因为T2DM患者发展为DR的危险因素，而CC基因型可能是发展为DR的暴露基因型，AA基因型为其保护基因型。

基因多态性；糖尿病性视网膜病变；血管内皮生长因子；危险因素

糖尿病性视网膜病变 （diabetic retinopathy, DR）无论是在眼科还是内分泌科均是非常棘手且预后很差的疾病，据统计发现糖尿病患者无论是1型还是2型几乎均会在15年内发展成为不同程度的DR[1]。目前世界卫生组织发布消息称，将把DR的预防以及治疗作为世界第二大防盲重点眼病[2]。DR作为一个多因素共同作用的疾病[3]，不仅与患者血糖、血压的控制有关，还存在明显家族聚集现象，不同人种、地区其发病率也有明显差异，比如亚洲人和欧洲人，外来的影响可能随着环境的改变而变化，而基因的影响却很少被外界所干扰，此外，我们还发现，即便是同一类型的DR，不同人发生的风险也不尽相同。因此，越来越多的研究者关注点开始由病理生理水平转向了基因水平的研究[4-6]。

血管内皮生长因子 （vascular endothelial growth factor,VEGF）是DR发生发展中重要的致病因子，研究发现在DR患者血清、玻璃体中VEGF水平较正常人明显升高，而通过对大量国内外研究进行Meta分析发现[7]，VEGF-2578C/A基因多态性与DR的发生发展相关，但不同地区的研究结果却存在差异，为此我们推测，不同种族、人群DR患者-2578C/A基因内可能含有使VEGF表达水平变化的基因变异，而国内对此基因研究较少，因此，针对中国泸州地区DR患者我们进行了相关研究。

1 研究对象及方法

1.1 研究对象

按照国际糖尿病性视网膜病变诊断标准及世界卫生组织 （WHO）1999年提出的糖尿病诊断标准选取来自我院2014年5月至2015年10月门诊及住院部患者262例纳入本次研究，其中，DR患者158例 （DR组），2型糖尿病 （Type 2 diabetes mellius, T2DM）患者104例（T2DM组），同时抽取我院门诊健康体检者164例作为对照组，所有对象均排除其他器官急慢性病史及妊娠妇女，均为中国汉族，彼此无亲缘关系。

1.2 研究方法

抽取研究对象肘静脉血9ml，其中3ml用于基因检测DNA的提取，其余6ml送检测总胆固醇（Total Cholesterol,TC）、甘油三酯（Triglyceride,TG）、糖化血红蛋白（GlyoohemoglobinA1c,HbA1c），用酚／氯仿抽提法提取全血DNA，根据Genebank数据库及查阅相关VEGF-2578C/A文献，用Primer Premier 5.0设计引物，并由美国NEB公司合成，上游：5’-GCCTTAGGACACCATACCGATG-3’，下游：5’-GCTGCCCCAGGGAACAAAGTTG-3’，运用PCRRFLP法扩增产物后进行酶切，在紫外线凝胶成像系统下最终可得到285bP、206bP、79bP三种片段。

1.3 统计学方法

所有数据统计分析采用SPSS18.0软件包进行。检验所有基因型频率是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡；对各实验数据及临床检查数据进行正态性检验，正态分布的资料用（±s）表示，计数资料用χ2检验；两组间的计量资料比较用t检验；两组以上的计量资料比较用方差分析；用Logistic回归分析法分析发生DR的危险性。以P＜0.05表示有统计学意义。

2 结 果

2.1 Hardy-Weinberg遗传平衡检验

对各组基因型进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验，结果显示，DR组χ2＝0.04,P＝0.83;T2DM组χ2＝1.05,P＝0.30；正常对照组χ2＝0.11,P＝0.74，所有研究对象均P＞0.05说明样本来自同一孟德尔群体。

2.2 各组临床基本数据检验

表1中我们可以看出，相比正常组，DR组与T2DM组患者无论是BMI、HbA1c、TC还是TG的指标均明显高于正常组（P＜0.05），DR患者其HbA1c虽明显升高，但却低于T2DM患者，且其差异具有统计学意义（P＜0.05）

2.3 各组基因型间的统计分析

从表2可以看出，三组对象VEGF-2578C/A均存在CC、AA、CA三种基因型，将各组基因型及等位基因进行比较分析，差异具有统计学意义 （χ2＝ 11.01,P＝0.02；χ2＝10.68,P＝0.00），将三组基因两两比较结果示：①DR组与正常对照组比较：DR组CC基因型所占比例明显较正常对照组比例高，结果示CC基因型为正常人发展成为DR的危险基因 （χ2＝7.59,P＝0.01），AA基因型为其保护基因（χ2＝15.94,P＝0.00）;②T2DM组与正常对照组无明显差异（P＞0.05）;③DR组与T2DM组比较结果示C等位基因为T2DM患者发展成为DR患者的危险基因（χ2＝4.74,P＝0.03），而AA基因型为其保护基因（χ2＝4.07,P＝0.04）。最后用多因素Logistic回归分析结果示CC基因型、糖化血红蛋白是正常人发展为DR的危险因素（表3）。

表1 各组研究对象基本信息之间的比较

表2 各组基因型及等位基因的数据及百分比比较

3 讨 论

DR作为具有较高致盲率的严重眼病，其眼底的改变主要包括血管通透性增加、组织缺血、新生血管的形成、软硬性渗出以及不同程度的出血，牵引性视网膜脱离等[8-9]，迄今为止仍然没有能够完全治愈DR的方法。大量研究发现，VEGF-2578C/A基因多态性主要由位于启动区2549区的大小约18bp的片段插入、缺失所决定。当存在2549片段插入时，则其碱基表现为A，若该片段缺失时则表现为C[10]。人类VEGF基因5’侧翼区呈高度的多态性，且与VEGF表达水平相关，Shahbaazi等[11]针对启动区2549区片段的不同也进行了相关研究发现，正常人中，VEGF-2578CC纯合子的人体内VEGF水平明显高于VEGF-2578AA纯合子，而VEGF-2578C／A杂合子的人其 VEGF表达水平居中，进一步说明了VEGF启动区2549区片段的差异与VEGF表达水平相关。然而，该区域内片段插入、缺失又存在种族差异，张英爽等[12]对不同种族健康人VEGF-2578C/A进行比较发现中国汉族VEGF-2578C/A各基因型频率分布中，CC为48.8%，CA为46.0%，AA为5.2%，其C等位基因为71.8%，A等位基因为28.2%，与欧洲人相比呈现明显差异，且欧洲AA基因型纯合子所占比例明显高于中国汉族，而这一观点与我们在表2中所列的研究结果较一致。我们对2014年4月之前所有关于欧洲人及亚洲人VEGF-2578C/A基因多态性的研究进行了 Meta分析，结果示欧洲人VEGF-2578A等位基因是DR发生的危险基因，而亚洲人分析结果示VEGF-2578C/A与DR的关系各结论并不一致，没有表现出明显趋势[7]。因此，除了研究国内外DR患者VEGF-2578C/A基因多态性与其发生发展的关系，我们更加需要大量针对我国各个民族及地区不同人群的大样本研究，才更具有说服力。

DR不仅与血糖、血脂及血压等因素有关，还受环境、基因的影响，表1中DR组与T2DM组患者无论是BMI、HbA1c、TC还是TG的指标均明显高于正常组（P＜0.05），说明了T2DM及DR往往会同时与其他慢性疾病共存，这也增加了研究难度，表中我们还能看出，DR患者其HbA1c虽明显升高，但却低于T2DM患者，其差异具有统计学意义（P＜0.05），该现象与我们过去所知血糖控制不佳是糖尿病患者发展为DR等严重微血管并发症的重要原因的结论有所不同，出现这种差异的原因可能是我们所研究的T2DM患者中存在首次明确诊断的患者，其血糖从未进行过正规的控制，往往HbA1c指标也比较高，而DR患者大部分为经过了正规治疗的复查患者，该现象也进一步说明了DR的发生可能不仅仅与血糖相关，同时还受到了其他因素的影响等。研究中我们对所有DR患者组、T2DM患者组及正常对照组的基因型及等位基因数据进行统计分析（表2），结果表明DR组与T2DM组及正常对照组间有差异，而T2DM组与正常对照组比较无统计学意义。在DR组与正常对照组比较可以看出，其CC基因型可能为其危险基因，但C等位基因是否为正常人发展为DR的危险等位基因却不能证明；在DR组与T2DM组等位基因比较中可以看出，C等位基因为其危险基因，AA基因型为其保护基因，而CC基因型可能为T2DM发展为DR的暴露因素；以上统计数据与Shahbaazi等[11]研究结论一致。表3中我们将有无DR作为因变量，CC基因型、糖化血红蛋白、年龄、BMI、胆固醇、甘油三酯作为自变量，用多因素Logistic回归分析研究各因素对DR发病的影响，结果示CC基因型、糖化血红蛋白是正常人发展为DR的危险因素。

通过搜索浏览国内外相关文献及对其进行Meta分析[7]，我们发现大部分欧洲人及部分亚洲、甚至国内研究者的研究结果提示VEGF-2578A等位基因是DR发生的危险基因，与本次研究结论有差异，出现此差异的可能原因包括：①人种、民族、环境的差异，DR是一个多基因及环境综合影响的疾病，易受不同生活环境等因素的影响；②本次研究样本量还不足够大，其结论仅能做一个趋势的参考，而不具备证明某一结论的能力；③正常对照组为来院健康体检患者的随机样本，大部分为公司职员或企业职工，极少部分为低收入人群、农民等，因此存在一定程度的选择偏移。我们仍需进一步扩大样本量，以得出更确切的趋势。

表3 正常人发生DR的危险因素分析

1.Khan ZA,Chakrabarti S.Growth factors in Proliferative diabetic retinoPathy[J].ExP Diabesity Res,2003,4（4）: 287-301.

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（2016-04-26收稿）

Association of VEGF-2578C/A gene polymorphism with the risk for diabetic retinopathy

Guo Lu,Li Youyi，Duan Chengxi，Lu Hongbing.
Department of Ophthalmology,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan province 646000,China

Objective:This study aimed to investigate the association of VEGF-2578C/A SNPs and the risk for DR in Chinese Han population.Methods:A total of 426 patients and healthy people were randomly recruited from The Affiliated Hospital of Southwest Medical University and its surrounding counties from May 2014 to Oct 2015,which included 158 cases of type 2 diabetic retinopathy （DR）,104 cases of type 2 diabetes mellitus（T2DM）,and 164 cases of healthy people（control）.The diagnostic criterions of diabetes were the standard of WHO and the international diagnose of diabetic retinopathy standards.Nine ml blood was taken from the elbow vein of each subject.Of the 9 ml of blood,3 ml was used to extract DNA,and the rest 6 ml was sent to clinical laboratory for biochemistry and HbA1c test.The VEGF-2578C/A polymorphisms was detected by Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length Polymorphism analysis（PCR-RFLP）.The biochemical data such as HbA1c,BMI,TC and TG were recorded at the same time.All data were analysed by SPSS18.0 software.The distribution of VEGF genotype was analysed by Chi-square analysis to test whether it fitted the Hardy-Weinbergequilibrium.Normally distributed data were presented as means±SD （±s）.Non-normally distributed data were presented as median（quartile range）.Measurable data between the two groups were compared using t or t’-test, three or more groups were compared using variance analysis;Numeric data were compared using Chi-square analysis.Risk factors for type 2 diabetic retinopathy were analyzed using multiple logistic regression analysis. .Results::Statistical analysis showed that DR and T2DM group had significantly higher HbA1c,BMI、TC、TG than the control group（P＜0.05）;VEGF-2578 C allele is significantly different between DR and T2DM groups（χ2＝4.74,P＝0.03）;VEGF-2578 CC alleles are the reason for the health people to develop DR （χ2＝7.59,P＝0.01）, and AA alleles maybe the protective factor for the healthy and patients with type 2 diabetes（χ2＝15.94,P＝0.00; χ2＝4.07,P＝0.04）.The multiple logistic regression analysis shows CC alleles and HbA1c are risk factors for the healthy people to develop DR.Conclusion::VEGF-2578C/A is associated with DR in Han Chinese in Luzhou, Sichuan,VEGF-2578 C allelic gene is the risk factor for type 2 diabetes mellitus to develop diabetic retinopathy，and VEGF-2578 CC gene type is the risk factor and AA gene type is the protective factor of DR in Han Chinese in Luzhou,Sichuan.

Genetic polymorphism;Diabetic retinopathy;Vascular endothelial growth factor;Risk factor

R774.1

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.03.009

*四川省科技支撑计划项目（2015SZ0086），四川省科技厅-泸州市-泸州医学院项目，（14JC01723-LH36）作者简介：郭 露（1989-），女，医师，硕士

吕红彬（1966-），女，教授，博士，E-mail:coulistlvhongbin@163.com