熊克宫 陈丽芳 柯坤宇



AIH患者外周血PD-1表达与肝脏炎症活动度的相关性分析

熊克宫 陈丽芳 柯坤宇

【摘要】目的 研究细胞表面程序性死亡受体1（PD-1）与肝脏病变程度的相关性。方法 收集43例AIH患者，并选择18例健康体检者为对照组。采用流式细胞术检测外周血CD4+、CD8+T细胞中PD-1的表达。结果 AIH组外周血CD4+、CD8+T细胞表达PD-1的细胞百分比高于对照组（P＜0.05）；AIH活动期组外周血CD4+、CD8+T细胞表达PD-1的细胞百分比高于缓解期组和对照组（P＜0.05）。外周血CD4+、CD8+T细胞PD-1的表达在AIH患者病理重度炎症组、轻度炎症组及缓解期逐渐下降（P＜0.05）。 结论 PD-1可作为评判肝脏炎症活动度的参考指标之一。

【关键词】自身免疫性肝炎；PD-1；T细胞；肝脏炎症活动度

自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）是一种病因和发病机制尚未完全明确的慢性进行性肝脏炎症性疾病［1］。程序性死亡受体1（programmed death-l，PD-1）是CD28家族中新发现的传导抑制信号的共刺激分子，主要功能是调节T细胞的活化及分化［2］。本研究以AIH患者为研究对象，探讨AIH患者外周血CD4+﹑CD8+T细胞PD-1表达情况及其与肝脏炎症活动度的相关性，为AIH的发病机制提供新的理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

43例AIH患者均为2013年1月～2015年8月福州市传染病医院收治并临床确诊的病例，31例为活动期（治疗前）患者，12例为免疫抑制剂治疗后缓解期患者。入选病例均经活体肝脏组织学检查并临床确诊的AIH患者，肝组织切片均由副主任医师以上病理专家阅片。AIH诊断标准：参照1999国际AIH工作组制定的诊断评分标准［3］，激素治疗前评分≥15分明确诊断AIH，10 ～15分者为疑似诊断AIH。缓解是指症状消失，血清转氨酶﹑胆红素﹑IgG正常，肝组织正常或无活动性肝硬化。同时选取18例年龄和性别配对的健康体检者为对照组。排除病毒性﹑药物性﹑酒精性和遗传代谢性肝病等。

1.2 主要试剂

鼠抗人CD4-FITC﹑鼠抗人CD8-FITC﹑鼠抗人CD3-perCP5.5﹑鼠抗人PD-1-APC﹑同型对照抗体IgG1-APC﹑红细胞裂解液（均购自美国BD公司）及1%的多聚甲醛（购自北京化学试剂公司）。

1.3 外周血T细胞PD-1表达的检测

每例采取外周静脉血5 ml，EDTA抗凝，6 h内送检。采集外周静脉血2 ml，肝素抗凝，取100 μl全血，分别加入小鼠抗人PD-l-PE CD3-FITC和CD4-APC﹑CD8-APC各10 ml，避光孵育30 min；加入2 ml红细胞裂解液避光静置10 min，加缓冲液洗涤3次后，取2%多聚甲醛300 L重悬细胞，立刻上机（BD FACS CantoTMⅡ型流式细胞仪）检测，用Cell Quest软件获取标本中的细胞，以FSC和SSC设门读取细胞，以CD3及CD4双阳性圈定为CD4+T细胞，以 CD3及CD8双阳性圈定为CD8+T淋巴细胞，再分别测定外周血CD4+﹑CD8+T细胞PD-1阳性比例。

1.4 肝组织标本采集和处理

患者均于入院病情稳定后在彩超引导下，采用巴德BARD一次性全自动活检枪进行检验（购自美国巴德公司，型号MN1620）。肝组织标本长度2.0 cm左右，汇管区数≥8个，4%甲醛固定，常规脱水﹑石蜡包埋﹑切片﹑HE染色。光学显微镜多视野观察。肝组织均由两名有经验的病理科医生独立阅片，进行组织学诊断，按照2000年《病毒性肝炎防治方案》中的组织病理学诊断标准，根据标本组织中肝细胞的变性﹑坏死和炎性细胞浸润程度，间质增生﹑细胞再生及纤维分隔的病理改变，将肝组织炎症活动度（G）分为G0～G4级。并按照慢性肝炎病理炎症程度分为三组： G1～G2为轻度炎症组﹑G3～G4为重度炎症组﹑G0为治疗缓解组。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，正态分布的计量资料以（均数±标准差）（±s）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象的一般情况

43例AIH患者，其中31例为活动期患者，男性3例﹑女性29例，平均年龄（47.2±12.4）岁，存在不同程度的肝功能异常﹑IgG升高﹑自身抗体阳性；12例为免疫抑制剂治疗后缓解期患者，男1例﹑女11例，平均年龄（48.6±11.8）岁，血清转氨酶﹑胆红素﹑IgG正常，但自身抗体仍为阳性，且与活动期比较，血清转氨酶﹑胆红素﹑GGT﹑ALP﹑IgG均下降，差异均有统计学意义（P＜0.05），但自身抗体谱﹑自身抗体的滴度差异无统计学意义（详见表l）。

表1　AIH患者一般情况

2.2 AIH患者肝组织病理特征

31例活动期AIH患者以界面性肝炎和汇管区淋巴细胞﹑浆细胞及单核细胞等炎症细胞浸润为主，且大部分肝小叶内可见点状或碎屑样坏死，多数不累计胆管。界面性肝炎29例（93.5%），淋巴﹑浆细胞浸润27例（87.1%），胆管破坏性炎症2例（6.45%）。12例缓解期患者无界面性炎，汇管区均无明显坏死及淋巴细胞﹑浆细胞浸润。

2.3 AIH组及对照组外周血CD4+﹑CD8+T细胞PD-1表达

AIH组的CD4+﹑CD8+T细胞PD-1表达率分别为（7.36± 4.45）%，（6.71±3.84）%均高于对照组（4.17±2.32）%，（3.47±2.18）%（P＜0.05）。活化期组CD4+T细胞表面PD-1的表达（8.73±6.81）%高于缓解期组（5.42±2.14）%及对照组（4.17±2.32）%（P＜0.05），且缓解期组高于对照组（P＜0.05）。活化期组CD8+T细胞表面PD-1的表达（7.44±2.75）%高于缓解期组（4.82±2.04）%及对照组（3.47±2.18）%（P＜0.05），且缓解期组高于对照组（P＜0.05）。并且AIH患者病理重度炎症组﹑轻度炎症组及缓解期外周血CD4+﹑CD8+T细胞PD-1表达逐渐下降（P＜0.05）。

2.4 AIH患者外周血CD4+﹑CD8+T细胞PD-1表达与肝组织炎症活动度相关性分析

AIH患者外周血CD4+﹑CD8+T细胞PD-1表达与肝组织炎症活动度分级正相关（r分别为0.852﹑0.882，P＜0.05）。

3 讨论

国外的研究者用免疫组化和RT-PCR对未接受治疗的AIH和PBC患者肝中PD-1的表达进行检测，发现在AIH组中PD-1的表达高于健康组及PBC。另外，在PD-Ll缺陷AIH小鼠中还观察到肝内聚积的凋亡功能受损的CD8+T细胞导致肝细胞损伤加快，说明PD-1/PD-L1介导的免疫异常参与了AIH发生发展。Miyake Y等研究发现血清PD-1抗体对于1型AIH是一个有用的诊断指标，且血清PD-1抗体水平能反映1型AIH临床特征。但AIH患者外周血T细胞PD-1的表达情况及与肝脏组织炎症病变程度之间的关系研究甚少。

本研究观察PD-1在AIH患者外周血CD4+﹑CD8+T细胞的表达，结果显示在AIH患者外周血CD4+﹑CD8+T细胞的表达高于对照组，AIH患者病理重度﹑轻度炎症组及缓解期肝组织PD-1逐渐下降。这可能说明AIH患者外周血CD4+﹑CD8+T细胞虽代偿性提高了PD-1的表达，但是表达PD-1的CD4+﹑ CD8+T细胞的增殖能力反而下降，不足以控制疾病的发生，导致机体免疫耐受失衡，以致其对免疫反应的抑制性调控作用不能显现，继而发生病变。PD-1在AIH活动期组外周血CD4+﹑CD8+T细胞的表达高于免疫抑制剂治疗后缓解期组。说明免疫抑制剂治疗药物等可能通过提高表达PD-1的CD4+﹑CD8+T细胞的增殖能力，下调PD-1的表达而发挥作用。此外，AIH患者外周血CD4+﹑CD8+T细胞PD-1的表达且与肝组织炎症活动度呈正相关。在机体激活特异性效应T淋巴细胞的同时，逐渐表达更多的PD-l，考虑可能为机体应对自身免疫反应的代偿所表现的反应。当这种平衡关系出现异常时，可以因免疫反应剧烈而引起免疫损伤。PD-1的升高与肝组织炎症活动度相关，炎症活动度越明显，机体通过产生更多的PD-1，抑制反应性T淋巴细胞，从而能够减轻自身免疫损伤。

综上所述，本研究发现AIH患者外周血CD4+﹑CD8+T细胞表面PD-1表达率增加，且与肝组织炎症活动度呈正相关，提示PD-1在AIH的发生及发展中发挥重要作用，且外周血PD-1可作为评判肝脏炎症活动度的参考指标。

参考文献

［1］林惊世.3种核苷类似物治疗慢性乙型肝炎的成本-效果分析［J］.药学实践杂志，2011，29（6）：475-477.

［2］陈雪霞.抗病毒药物对慢性乙肝患者肾功能影响的研究［J］.西北药学杂志，2015，30（6）：725-728.

［3］刘小琴，张大志，郭树华，等.替比夫定治疗慢性乙型肝炎患者3年的临床观察［J］.重庆医科大学学报，2012，37（7）：637-641.

Expression of PD-1 on Peripheral Blood T Cells and the Correlation With Liver Inflammatory Activity in Patients With Autoimmune Hepatitis

XIONG Kegong CHEN Lifang KE Kunyu Department of Liver Deseases，The Infection Disease Hospital of Fuzhou City，Fuzhou 350012，China

【Abstract】

Objective To investigate the correlation of programmed cell death receptor 1（PD-1）with liver inflammatory activity.Methods The percentages of PD-1 on CD4+，CD8+T lymphocytes in peripheral blood of patients with AIH（n=43）and healthy controls（n=18）was determined by flow cytometry.Results We found that the percentages of PD-1 on CD4+，CD8+T lymphocytes in peripheral blood of patients with AIH were higher than the healthy controls.The percentages of PD-1 on CD4+，CD8+T lymphocytes peripheral blood in activity stage，remission stage and the control groupwere gradually declined.The expression of PD-1 in severe inflammation，mild inflammation and remission stage were gradually decline，and PD-1 expression was a positively correlated with inflammation grading of hepatitis tissues.Conclusion PD-1 can be used as a reference index evaluation of liver inflammatory activity.

【Key words】Autoimmune hepatitis，Programmed cell death receptor 1，T cells，Liver inflammatory activity

基金项目：福州市卫生系统科技计划项目（2014-S-w21）

doi：10.3969/j.issn.1674-9316.2016.02.025

【中图分类号】R575.1

【文献标识码】A

【文章编号】1674-9316（2016）02-0034-03

作者单位：350012 福州市传染病医院肝病科 通讯作者：柯坤宇，E-mail：465347646@qq.com