宗振平，朱　琪，钱婉莹，钟友刚，许剑琴，刘凤华（.中国农业大学动物医学院，北京海淀0093；.北京农学院动物科学技术学院，北京昌平006）



犬子宫内膜上皮细胞和基质细胞的分离培养与鉴定

宗振平1，朱琪1，钱婉莹1，钟友刚1，许剑琴1，刘凤华2
（1.中国农业大学动物医学院，北京海淀100193；2.北京农学院动物科学技术学院，北京昌平102206）

摘要：为了探究犬子宫内膜细胞的培养方法，采用组织块培养法和酶消化培养法进行细胞培养并使用倒置显微镜观察细胞的形态结构和生长状态，对细胞进行免疫组化鉴定。结果表明，组织块培养法需要1周左右培养出犬子宫内膜上皮细胞，且细胞不易纯化；酶消化培养法节省时间，获得的细胞活力强、纯度高。综上所述酶消化培养法更适于培养犬子宫内膜细胞，为后期细胞水平研究奠定基础。

关键词：犬；子宫内膜细胞；组织块培养法；酶消化培养法

1　材料与方法

1.1子宫来源子宫由中国农业大学动物医院提供，为正常犬进行子宫与卵巢切除术（OHE）后的子宫，子宫内膜生长阶段为间情期。

1.2主要试剂和仪器DMEM/F12（GIBCO）；胎牛血清（GIBCO）；EDTA-胰蛋白（GIBCO）；Ⅰ型胶原酶（GIBCO）；PBS（GIBCO）；超净工作台（苏州净化设备有限公司）；倒置相差显微镜（重庆奥特光学仪器有限责任公司）；CO2细胞培养箱（香港力康生物医疗科技控股集团）；TDZ5-WS多管架自动平衡离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）。

1.3方法

1.3.1子宫取样使用保温桶加入200 mL的生理盐水（含100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素）将做完子宫与卵巢切除术（OHE）的子宫带回实验室。在无菌环境下，首先将子宫周围的其余组织剪除，然后使用加入双抗的生理盐水对子宫进行冲洗。子宫外部冲洗干净后，使用手术剪在子宫角与卵巢的交界剪1个小孔，使用注射器抽取加入双抗的生理盐水对子宫内部进行冲洗。

1.3.2组织块培养法在超净工作台中，准备好加入双抗的生理盐水、玻璃平皿、5 mL玻璃瓶、15 mL离心管，在玻璃平皿和玻璃瓶中加入双抗生理盐水。子宫冲洗完毕后放入到加双抗生理盐水的玻璃平皿中，将子宫角剪开，使用手术剪将子宫内膜从肌层上分离下来放入小玻璃瓶中，然后将组织块剪碎到体积大约为1 mm3（分离的组织块内血细胞含量较多时，剪碎前使用生理盐水冲洗2～3次）。组织块被剪碎后使用加入双抗的生理盐水冲洗干净，冲洗完毕后使用移液枪将组织块移入到15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min，离心后使用PBS冲洗2～3次。使用PBS冲洗完毕后，在离心管中加入3～4倍组织块体积的3%胰酶37℃水浴1 min，然后1 000 r/min离心5 min。丢弃上清液，根据组织的量，加入少量培养基混匀（培养基的量尽可能的少）。将混匀的组织块分装到细胞瓶中铺匀，组织块密度大约为5块/cm3。组织块分布均匀后，将细胞瓶倒置放入CO2培养箱中4 h促进组织块贴壁，4 h后将细胞瓶慢慢翻转过来静置培养。24 h后进行补液，加入1.5 mL培养基继续培养。以后每天观察组织块的生长状态，每2 d换液1次，每次加入3 mL培养基。

1.3.3酶消化培养法酶消化法的前期组织块处理同组织块法，使用PBS冲洗完后在离心管内加入3～4倍体积的5%的Ⅰ型胶原酶，37℃水浴50 min。进行水浴时离心管要全部浸入水中，每隔10 min震荡混匀1次。水浴完毕后，加入PBS对消化液进行稀释（便于进行过滤）。首先使用80目的过滤网对稀释后的消化液进行过滤（该过程主要将消化后的肌肉组织与细胞分离），然后使用300目的细胞筛对第一次过滤后的细胞悬液进行过滤（该过程主要将上皮细胞团及上皮细胞和基质细胞分离），使用300目的滤网进行过滤后上皮细胞团及单个上皮细胞则保留在滤网上方，使用PBS对滤网上保留的细胞团和细胞进行冲洗，冲洗后使用移液枪将冲洗液移入离心管中，1 000 r/min离心5 min，丢弃上清后的沉淀即为上皮细胞团和单个上皮细胞。根据细胞量使用培养基将细胞稀释到2×105个/mL，然后将细胞悬液移入细胞培养瓶中，做好标记放入CO2培养箱中静置培养。300目滤网过滤后的细胞液中主要为基质细胞，将细胞液移入离心管中，1 500 r/min离心10 min，沉淀即为基质细胞。使用培养基将基质细胞浓度稀释到5×105个/mL，然后将细胞悬液移入细胞培养瓶中，做好标记放入CO2培养箱中静置培养。

1.3.4H.E.染色镜下观察细胞爬片，细胞贴壁生长完毕后取出进行H.E.染色。首先使用PBS冲洗载玻片2次，每次1 min；使用4%多聚甲醛进行固定20 min，PBS漂洗两次，每次1 min；使用苏木精染色10 min，自来水洗涤；镜下观察细胞核染色，如染色多深则使用1%盐酸酒精分色数秒，自来水洗涤；使用伊红染液染色3 min，自来水洗涤；染色完毕后将载玻片晾干，使用中性树胶封片。

1.3.5免疫组化鉴定将无菌盖玻片置于六孔板中，将调节好的细胞悬液滴加在盖玻片上进行培养。显微镜下观察，待细胞长满后，取出盖玻片，用90%乙醇固定10 min，PBS漂洗。上皮细胞使用犬特异性的角蛋白抗体按照操作进行染色，基质细胞使用犬特异性的波形蛋白抗体按照操作进行染色。使用PBS做阴性对照组进行染色，光学显微镜下观察染色结果。

习近平总书记指出：“只有坚持爱国和爱党、爱社会主义相统一，爱国主义才是鲜活的、真实的，这是当代中国爱国主义精神最重要的体现。”[注]习近平：《习近平在中共中央政治局第二十九次集体学习时强调：大力弘扬爱国主义精神 为实现中国梦提供精神支柱》，《人民日报》2015年12月31日，第1版。爱国主义是一个历史范畴，爱国主义和热爱中国共产党、热爱社会主义制度、热爱中国特色社会主义相统一、相一致，是由没有共产党就没有新中国、只有社会主义才能救中国、只有中国特色社会主义才能发展中国、只有中国共产党才能带领中华民族实现伟大复兴中国梦的历史事实和现实逻辑所决定的。

2　结果

2.1组织块法原代培养细胞体外生长方式和形态特征

2.1.1基质细胞组织块法培养的基质细胞在组织块贴壁后24 h内即向外游离，细胞绝大部分为单个向外游离。在游离初期细胞呈梭形，游离细胞相互连接后细胞增殖生长呈束为多边形。

2.1.2上皮细胞组织块培养法中上皮细胞大约在7 d左右开始向外游离。如图1所示，上皮细胞呈梭形沿组织块呈圆环形向外生长，以细胞团的方式存在，细胞之间紧密连接，胞质透明，细胞核轮廓清晰，核仁明显。

2.2酶消化法原代培养细胞体外生长方式和形态特征

2.2.1基质细胞图2为接种24 h后的基质细胞，可见细胞单个生长呈梭形。酶消化法接种的基质细胞在培养4 h后贴壁，24 h后处于增殖状态，48 h后基质细胞体积变为原来的2～3倍，连接成片，细胞间连接紧密，呈漩涡状。

图1　组织块培养法中向外游离的上皮细胞（4×10）

图2　酶消化法接种24 h后的基质细胞A：4×10镜下的基质细胞；B：4×20镜下的基质细胞

2.2.2上皮细胞图3为培养24 h后的上皮细胞，可见上皮细胞连接紧密，轮廓清晰，形态呈梭形。上皮细胞在培养8 h后贴壁，24 h后开始增殖，上皮细胞连接成片后细胞形态依然保持梭形，细胞间连接紧密。48 h后上皮细胞仍保持梭形，有一部分已经细胞衰老。

图3　酶消化法接种24 h后的上皮细胞A：4×10镜下的上皮细胞；B：4×20镜下的上皮细胞

2.3H.E.染色

2.3.1基质细胞如前插彩版图4-A、B所示H.E.染色后基质细胞的形态更加明显，基质细胞核呈蓝色，细胞质呈紫色。细胞形态为多边形，轮廓更加明显。

2.3.2上皮细胞如前插彩版图5 -A、B所示H.E.染色后可见上皮细胞延组织块向外扩散生长，细胞与细胞间连接紧密，长成一片。细胞核为蓝色，细胞质为紫色。细胞形态结构明显，细胞间连接染色后也更加明显。

2.4免疫组化细胞鉴定试验

2.4.1基质细胞如中插彩版图6所示，使用犬特异性波形蛋白抗体进行免疫组化试验后镜下观察基质细胞细胞质呈棕黄色，PBS阴性对照组基质细胞不着色。使用苏木精染液复染后，镜下观察基质细胞细胞核呈蓝色。

2.4.2上皮细胞如中插彩版图7所示，使用犬特异性角蛋白抗体进行免疫组化试验后镜下观察上皮细胞细胞质呈棕黄色，PBS阴性对照组上皮细胞不着色。使用苏木精染液复染后，镜下观察基质细胞细胞核呈蓝色。

3　讨论

人子宫内膜细胞培养中Akoum A等研究中采用Matthews C J的方法将组织剪碎，使用Ⅰ型胶原酶进行孵育消化，通过2 000 r/min离心10 min将腺细胞和基质细胞分离[1-2]，Tuckerman E等研究中将收集的人子宫内膜剪成1～3 mm3大小，使用0.2%Ⅰ型胶原酶进行37℃水浴1 h，每30 min进行吹打1次，使消化下来的细胞分散开，经过1 000 r/min离心5 min获得腺上皮细胞，剩下的组织同样条件继续进行消化1 h，然后离心分离获得颗粒型上皮细胞[3]。国内研究中戈一峰等研究中使用1.25%Ⅰ型胶原酶进行37℃水浴1.5 h，先用80目筛网初筛，然后用300目复筛，基质细胞通过细胞筛，而上皮细胞留在筛网上，使用PBS冲洗筛网即可获得上皮细胞，过网的滤液则通过离心获取基质细胞[4]。秦莉花等使用加入EDTA 的0.25%胰酶、0.1%胶原酶和0.1%透明质酸混合体积为剪碎组织的3倍进行消化，每20 min终止消化1次，取上清液，加入配好的培养基终止培养，剩余部分按同样条件继续消化，共消化6次，消化完毕经过处理即获得子宫内膜上皮细胞和基质细胞[5]。陈晓岚等使用1.25%Ⅰ型胶原酶消化剪碎组织1.5 h，使用80目和300目细胞筛进行初筛和复筛，基质细胞进行500 r/min离心10 min，然后冲洗干净进行培养，筛网上的上皮细胞被冲洗下来，沉淀后培养[6]。人的子宫内膜细胞培养大部分使用Ⅰ型胶原酶的方法进行消化，处理方式大致相同。

目前国内对于奶牛、绵羊、兔和小鼠的子宫内膜细胞培养均有研究[7-11]，张雷等分别使用组织块法和酶消化法进行奶牛子宫内膜上皮细胞的培养，组织块法是将组织剪碎后直接加入培养基进行倒置培养，2～4 h后翻转培养瓶进行培养，酶消化法先使用0.3%胰蛋白酶进行37℃水浴40 min，吸取悬液使用双层纱布过滤，未消化的组织块使用PBS冲洗，获得上皮细胞悬液，剩余的组织块使用0.1%Ⅱ型胶原酶进行37℃水浴2 h，将第1次和第2次的消化液合并，加入培养基终止消化，1 000 r/min离心10 min，获得的细胞使用培养基进行稀释培养[8-9]。

国外Kovacs G.等使用酶消化法进行犬子宫内膜细胞培养，使用1%Ⅰ型胶原酶进行37℃水浴2～3 h，然后先使用250 μm的细胞筛除去肌肉组织和未消化完全的组织，然后使滤液通过40 μm的细胞筛，通过两次筛滤获得犬子宫内膜基质细胞和上皮细胞[12]。国内目前没有犬子宫内膜细胞培养的相关研究，本试验中培养条件是根据人和各种动物的研究进行摸索得出。在细胞培养过程中细胞密度的调整非常关键，细胞悬液密度一般为2×105/mL。密度过低细胞不易建立细胞连接，细胞不易进行增殖；密度过高细胞生长过密，容易导致细胞活性降低。在细胞生长过程中要注意掌握犬子宫内膜基质细胞和上皮细胞的生长周期，基质细胞在24 h内增殖较快，细胞保持梭形状态。本试验使用组织块法和酶消化法两种方法进行犬子宫内膜细胞培养，其中酶消化法节省时间，获得的细胞活性、细胞纯度较高，适于培养犬子宫内膜细胞。

参考文献：

[1] Akoum A，Lemay A，Brunet C，et al.Cytokine-induced secretion of monocyte chemotacncprotein-1 by human endometnotic cells in culture[J] . American Journal of Obstetrics and Gynecology，1995，172：594-600.

[2] Akoum A，Lemay A，Paradis I，et al . Secretion of interleukin-6 by human endometriotic cells and regulation by proinflammatory cytokines and sex steroids[J] . Human Reproduction，1996，11：2269-2275.

[3] Tuckerman E M，M Sc，Okon M A，et al.Do androgens have a direct effect on endometrial function.An in vitro study[J].FERTILITY AND STERILITY，2000，74（4）：771-779.

[4]戈一峰，黄宇烽，胡毓安，等.人子宫内膜细胞的纯化和培养[J].医学研究生学报，2005，18（6）：496-498.

[5]秦莉花，秦明春，李晟，等.人子宫内膜细胞原代体外培养方法[J].湖南中医药大学学报，2007，27（3）：8-10.

[6]陈晓岚，黄仁彬，欧海燕，等.人子宫内膜细胞的体外纯化和培养[J].生殖与避孕，2006，26（9）：530-532.

[7]陈利平，朴学娇，罗永，等.奶牛和绵羊子宫内膜细胞体外培养方法的研究[J].中国农学通报，2012，28（14）：99-104.

[8]张雷，张振新，王亨，等.奶牛子宫内膜上皮细胞和间质细胞的组织块培养及鉴定[J].中国兽医杂志，2008，44（4）：21-24.

[9]张雷，王亨，曹杰，等.奶牛子宫内膜上皮细胞和间质细胞的分离、培养及鉴定[J].黑龙江畜牧兽医，2008（6）：8-10.

[10]李瑞梅，陈秀荔，王海滨，等.家兔子宫内膜细胞和平滑肌细胞的分离培养及鉴定[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2007，35（6）：19-23.

[11]张勇法，杨建英，秦翠丽.小鼠子宫内膜上皮细胞的分离和原代培养[J].重庆医学，2011，40（22）：2236-2240.

[12] Kovacs G G，Walter I，Aurich C，et al.Steroid receptors in canine endometrial cells can be regulated by estrogen and progesterone under in vitro conditions[J].Theriogenology，2004，61：963-976.

Isolation，Cultureand Identification of Canine Endometrial Epithelial Cells and Stromal Cells

ZONG Zhen-ping1，ZHU Qi1，QIAN Wan-ying1，ZHONG You-gang1，XU Jian-qin1，LIU Feng-hua2
（1.College of veterinary medicine，China Agriculture University，Beijing 100193，China；2.Animal science and technology college，Beijing Univercity of Agriculture，Beijing 102206，China）

Abstract：To study the methods for culturing canine endometrial cells，tissue block culture method and enzymatic digestion culture method were used in this study . Cells were identified by immunohistochemical staining，the morphological structure and growth status of endometrial epithelium cells were observed by inverted phase-contrast microscope .Our results showed that tissue block culture method which is not easy to purify cells took longer time to get endometrial epithelium cells than the enzymatic digestion culture method.The enzymatic digestion culture method got high-viability and high-purity cells in 24 hours.In conclusion，enzymatic digestion culture method is appropriate for canine endometrial cell culture，which can be used for the further study.

Key words：canine；endometrial cells；tissue block culture method；enzymatic digestion culture method

Corresponding authors: XU Jian-qin；LIU Feng-hua

通讯作者：许剑琴，E-mail：jianqinxucau@126.com；刘凤华，E-mail：liufenghua1209@126.com

作者简介：宗振平（1988-），女，硕士，研究方向为小动物中兽医，E-mail：lanberzong@163.com

基金项目：“十二五”国家科技支撑计划重点项目：防制畜禽呼吸、消化系统常见病证中兽药创制及应用示范（2011BAD34B-01）；北京市教委创新团队的建设与教师职业发展的项目（PXM2-013_014207_000067）

收稿日期：2014-06-12

中图分类号：S858.292

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2016）01- 0020- 04