宋志慧　张元园　柳 宁　李东阳

(青岛科技大学环境与安全工程学院， 山东 青岛　266042)



有机农药百草枯对金鱼藻的生理生化参数的毒性作用

宋志慧张元园柳 宁李东阳

(青岛科技大学环境与安全工程学院， 山东 青岛266042)

摘要：采用静态模拟方法，研究了金鱼藻(Ceratophyllum demersum L)在不同浓度(0、0.05、0.1、0.15、0.25 mg/L)百草枯胁迫下叶绿素含量、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶(SOD)和多酚氧化酶(PPO)活性的变化。结果表明：在百草枯胁迫下，叶绿素和可溶性蛋白含量受到强烈抑制，0.25 mg/L实验组与对照组比较，叶绿素含量下降了60.23%，可溶性蛋白含量下降了67.76%；PPO和SOD均为氧化还原酶，金鱼藻受百草枯胁迫程度较轻时，为抵御外界胁迫PPO和SOD活性升高；当胁迫程度超过机体抗氧化防御能力时，酶活性下降，于是呈现“低促高抑”的变化趋势。

关键词：百草枯；金鱼藻；叶绿素；SOD；PPO；可溶性蛋白

0引言

农药是一种重要的生产资料，对粮食生产与农业发展有着重要作用。世界范围内农药防治农业病、虫、草害挽回的损失占总产量30%[1]。农药经喷洒之后，一部分会直接进入大气，随降水排入河流中，一部分则渗入泥土，经雨水冲刷流入河流湖泊中，继而进入饮用水或进入植物动物体内，影响人类的健康。

根据农药用途不同可以分为除草剂、杀虫剂、杀菌剂、杀螨剂等，根据化学成分不同可以分为有机氯类、有机磷类、酰胺类、氨基甲酸酯类等。

我国是一个农业大国，农药的大量使用已经对我国水系统造成了严重的危害。经调查，在我国长江流域，尤其是长江中下游地区因为蔬菜及经济作物的大量种植，使得一些有机磷、氨基甲酸酯类农药得到广泛使用，因此此地区农药累积量较高。作为我国七大水系中水质最好的水系，其水体也已经受到了农药的污染，可见，农药对我国水体的污染形势已相当严峻。

金鱼藻(Ceratophyllumdemersum)是多年生沉水草本植物，属金鱼藻科金鱼藻属，在国内和世界具有广泛分布，多生长于淡水池沼，湖泊及河流中，常在1~3 m深的水域中形成密集的水下群落。金鱼藻在环境污染和生态的治理中有较明显的作用，例如吸附累积去除水中的重金属离子[5]，克制水中有害藻类生长[6]，除磷脱氮[7]等。因而国内外对于金鱼藻的研究也逐渐增多。

1材料与方法

1.1实验材料

供试植物金鱼藻(Ceratophyllumdemersum)来源于江西宿迁市沐阳县，经洗净后放入曝气澄清的自来水中驯化3天后，置于7 L桶内用1/4 Hoagland营养液预培养2周，放入25℃恒温培养箱，光照强度为3000 Lux，光暗比为24：0，隔天更换培养液。

百草枯实验培养液由1/4 Hoagland营养液以及200 g/L百草枯原药稀释液组成，实验共设置5个浓度梯度，分别为0、0.05、0.1、0.15、0.25 mg/L，每浓度设4个平行组，选取长约15~20 cm、鲜重约1 g、生长状况良好的植株随机分组，每组6株，在500 mL烧杯中培养。7天后测定金鱼藻的叶绿素的含量、PPD和SOD活性、可溶性蛋白含量。

叶绿素含量的测定：取一定质量的金鱼藻，吸干水后称量计重。将金鱼藻放入匀浆器中，加入2 ml 无水乙醇研磨成匀浆，将匀浆移入到10 ml离心管内，分别用2 ml无水乙醇冲洗匀浆器并将清洗液一并移入离心管。在4 000 r/min 下离心10分钟。取上清液到25 ml比色管内定容至10 ml[8]。用无水乙醇作为对照，用分光光度计分别在645 nm、663 nm处测量吸光度。

叶绿素含量的计算：C(a+b)=(20.21A645+8.02A663)×0.01/G

公式中：C(a+b)为叶绿素含量，mg/g；

A645、A663分别为645 nm 及663 nm处测量的吸光度；

G 为称量的金鱼藻质量，g。

多酚氧化酶(PPO)的测定采用改进的比色法[9]：

由图1可以很明显看出，硬质合金与钢两侧界面区内有一定的反应产物形成。当间隙为0.05mm时反应产物贯穿了整个焊缝，随着接头间隙的增大，反应产物越来越不明显。因此，对界面区内产物及钎缝中心区的元素构成进行分析有助于确定界面区产物的类型及钎焊接头形成机理。

(1) PPO提取：分别称取0.5 g吸干水后的金鱼藻，放入匀浆器中，加入2 ml pH 5.5柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液研磨成匀浆，再将匀浆转移到离心管内，在5000 r/min下离心10 min。取上清液于10 ml比色管中，再加入相应体积的pH 5.5柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液使W:V=1:10，即得粗酶液上清液为PPO提取液。

(2) 酶活力检测：取0.1 ml PPO酶液加入比色皿，加入pH 5.5柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液2.9 ml，再加入0.1 mol/L邻苯二酚溶液1 ml。迅速测量410 nm处的吸光度变化。以pH 5.5柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液3 mL+0.1 mol/L邻苯二酚溶液1 mL作为空白，每30 s记录一次吸光度，测量3 min。1 ml酶液在1 min内使吸光度值变化0.001定义为一个酶活力单位(U/(mL·min)。

超氧化物歧化酶(SOD)的测定采用邻苯三酚自氧化法[10]。

可溶性蛋白的测定采用考马斯亮蓝法[11]。称取不同处理的金鱼藻(用吸水纸吸干)1 g于匀浆器中，加入pH=7.8的磷酸缓冲液，磨成匀浆，在5 000 r/min下离心10 min，提取上清液，定容和混匀。吸取定容后的样品提取液1 ml，放入具塞刻度试管中，加入5 ml考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2 min后再595 nm下比色，记录吸光度值，通过标准曲线计算得到蛋白质含量。

1.3数据分析

数据取平均值，用Origin8.5软件绘图。用SPSS16.0统计软件分析，在P=0.05的置信水平下对数据进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)。

2结果与分析

2.1金鱼藻在不同浓度的百草枯染毒作用下叶绿素含量的变化

不同浓度百草枯处理下叶绿素含量见图1。随着百草枯质量浓度的增加，金鱼藻体内叶绿素含量逐渐减少，实验组与对照组比较，均存在极显著差异(p<0.01)。染毒液浓度为0.05 mg/L时，实验组叶绿素含量为对照组的94.15%；当染毒液浓度大于0.05 mg/L时，叶绿素含量迅速下降，0.10 mg/L实验组叶绿素含量仅为对照组的48.15%，随后叶绿素含量继续下降，但下降缓慢，0.25 mg/L实验组与对照组比较，叶绿素含量下降了60.23%。百草枯对金鱼藻叶绿素的合成起到抑制作用且效果明显。

图1　金鱼藻在不同浓度百草枯作用下叶绿素的含量(**：表示与对照组差异极其显著，P<0.01，下同)

2.2金鱼藻在不同浓度的百草枯染毒作用下多酚氧化酶(PPO)的变化

不同浓度百草枯处理下金鱼藻的PPO活性变化如图2。金鱼藻体内PPO活性随百草枯染毒浓度的升高呈现先增后降的趋势。低浓度组(0.05 mg/L和0.10 mg/L)染毒液促进PPO活性，PPO活性最高为对照组的1.98倍。高浓度组(0.15、0.25 mg/L)染毒液抑制PPO活性。0.25 mg/L实验组PPO活性仅为对照组的38.41%。且所有实验组与对照组比较均存在极显著差异(p<0.01)。PPO活性呈现低促高抑的趋势，其原因可能是百草枯对植物细胞的损伤造成金鱼藻PPO活性的下降。

图2　PPO活性受百草枯的影响

2.3金鱼藻在不同浓度的百草枯染毒作用下超氧化物酶(SOD)的变化

不同浓度百草枯处理下金鱼藻的SOD活性变化趋势与PPO活性变化趋势相同，呈现先升高后下降的趋势(图3)。低浓度组(0.05、0.10 mg/L)染毒液促进SOD活性，SOD活性最高为对照组的2.25倍。高浓度组(0.15、0.25 mg/L)染毒液抑制SOD活性。0.25 mg/L实验组SOD活性仅为对照组的77.33%。0.15 mg/L实验组与对照组比较，存在显著差异(p<0.05)，其他实验组与对照组相比均存在极显著差异(p<0.01)。

图3　SOD受百草枯的影响

2.4金鱼藻在不同浓度的百草枯染毒作用下可溶性蛋白含量的变化

不同浓度百草枯处理下金鱼藻的可溶性蛋白含量变化如图4。金鱼藻中可溶性蛋白含量随百草枯浓度的升高而发生明显的下降，实验组与对照组比较均存在极显著差异(p<0.01)。0.05 mg/L实验组可溶性蛋白含量仅为对照组的73.74%，染毒液浓度为0.25 mg/L时，可溶性蛋白的含量相对于对照组下降了67.76%，说明百草枯对金鱼藻的蛋白质合成呈现明显的抑制作用，并且毒害作用较显著。

图4　金鱼藻在不同浓度百草枯染毒下可溶性蛋白的含量

3结论

叶绿素是植物进行光合作用的色素，是一项反映植物生长状况的重要生理生化指标。实验结果表明，金鱼藻中叶绿素的含量随百草枯浓度的增大而逐渐下降，说明百草枯对金鱼藻体内叶绿素的合成起到明显的抑制作用，百草枯浓度>0.05 mol/L时，金鱼藻体内叶绿素含量迅速下降，说明百草枯对金鱼藻的生长有明显的抑制作用。

植物细胞中可溶性蛋白含量作为植物代谢和生理状态的一个重要指标，其变化反映细胞内蛋白质合成、变性及降解等多方面的动态。实验结果表明，金鱼藻中的可溶性蛋白含量随百草枯浓度的增加逐渐下降，当百草枯浓度达到0.25 mg/L时，可溶性蛋白的含量相对于对照组下降了67.76%，说明水体中的百草枯会严重影响金鱼藻中蛋白质的合成，从而抑制金鱼藻的正常生长。

李玲等[16]选择了浮萍、兰氏萍、紫萍、金鱼藻、水鳖、伊乐藻和菹草7种植物开展了百草枯的敏感性研究，结果也表明在百草枯的胁迫下，各种植物的POD、CAT、SOD、MAD均呈增加趋势，可溶性蛋白也都有所降低，且从各个单一的5个指标分析来看，金鱼藻的敏感性排第二。由此得出结论，金鱼藻对于百草枯的胁迫具有灵敏的生理生化反应，在实际应用中，金鱼藻适合作为水体百草枯污染的表征植物，可用来快速发现水体中的百草枯污染。

参考文献

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Toxic effect of organic pesticide Paraquat on physiological and biochemical indexes ofCeratophyllumdemersumL

Song Zhihui, Zhang Yuanyuan, Liu Ning, Li Dongyang

(Qingdao University of Science and Technology, Qingdao 266042, China)

Abstract:A static simulation method was conducted to study the changes of chlorophyll content, soluble protein content, superoxide dismutase (SOD) and polyphenol oxidase (PPO) activity of Ceratophyllum demersum under toxic effects of different concentration (0, 0.05, 0.1, 0.15, 0.25 mg/L ) Paraquat. The results showed that under Paraquat stress, chlorophyll and soluble protein contents were strongly inhibited, for example, compared with control group, the chlorophyll and soluble protein contents in the 0.25 mg/L experimental group decreased by 60.23% and 67.76% respectively.When Ceratophyllum demersum L. was exposed to lower concentration of Paraquat, PPO and SOD, a kind of oxidoreductases would show higher activity in order to resist the external stress; while for higher concentration of Paraquat, which presented stress exceeding PPO and SOD's antioxidant capacity, the activity would decrease, thus activity of PPO and SOD would be promoted under low stress, and suppressed under high stress.

Keywords:Paraquat; Ceratophyllum demersum L.；chlorophyll；SOD；PPO；soluble protein

中图分类号：X171.5

文献标志码：A

作者简介：宋志慧，男，1972年生，副教授，博士，硕士生导师，研究方向：生态毒理学。E-mail：zyy890616@163.com通讯作者： 张元园， E-mail: 1034180165@qq.com

收稿日期：2015-10-19；2015-12-17修回