陈凤莲，鲍　欢，曲　敏，李凌俐（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江省高等学校食品科学与工程重点实验室，黑龙江哈尔滨　150076）



冰结构蛋白抗冻活性检测研究进展

陈凤莲，鲍欢，*曲敏，李凌俐
（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江省高等学校食品科学与工程重点实验室，黑龙江哈尔滨150076）

摘要：通过介绍近年来海洋鱼类、昆虫类、植物类及细菌和真菌类冰结构蛋白的抗冻活性检测研究进展，对利用冰晶和热滞活性2种检测方法进行了较全面的阐述，并提出建立对冰结构蛋白抗冻活性的冰晶观察和差示扫描量热法测热滞活性的联合检测观点。

关键词：冰结构蛋白；冰晶；热滞活性

0　引言

冰结构蛋白（Ice structuring protein，ISP），又称为抗冻蛋白、不冻蛋白（Antifreeze protein，AFP）、热滞蛋白，具有控制冰晶生长、修饰冰晶形态和抑制重结晶三大特征[1]。ISPs能修饰冰晶的形态，即通过与水分子的特异性结合，改变冰晶的形态；ISPs能非依数性降低水溶液的冰点，而不影响其熔点，从而产生水溶液冰点温度和熔点温度的差异，二者之间的差值被称为热滞活性（Thermal hysteresis activity，THA）[2-4]。利用THA系数可以表示其抗冻活性。熔点越高（低）冰点越低（高），即二者差异越明显，表示ISPs的活性越强，所以通过THA可以评价一种ISPs的抗冻活性。目前，根据其特征，常用ISPs抗冻活性的检测方法可以归纳为3种[5]：一是冰晶观察检测法，该方法使用显微镜对冰晶形态进行观察，操作简单，冰晶形态直观性强，但由于是肉眼进行观察，误差较大；二是微量渗透压计法，该方法是根据体系结晶前后的渗透压变化，通过经验公式来计算THA，测定结果的精确度和重复性都较高，缺点在于无法精确控制和测定体系的冰晶含量，不利于进一步揭示结晶过程中体系发生的变化；三是差示扫描量热法（Differential scanning calorimetry，DSC），该方法由于能够对冰晶含量准确控制，得到结果的精确度和重复性比较高，使其成为目前对ISPs的THA检测最常用方法。目前，在评价ISPs的抗冻活性时,多数研究通过采用DSC检测其THA值来确定，没有全面反应出ISPs的特征。本文综述了海洋鱼类、昆虫类、植物类、细菌与真菌类的ISPs抗冻活性检测方法，旨在提出全面检测与评价ISPs抗冻活性的方法。

1　海洋鱼类ISPs的抗冻活性检测

1969年斯坦福大学Devries在南极Mcmurdo海峡的一种Nototheneniid鱼血液中首先发现了具有这种性质的ISPs。接着，Jong Kyu Lee等人[6]提取了南极鱼类中的蛋白，将其纯化后与大肠杆菌提取液和磷酸盐缓冲液进行冰晶形态的对比观察，发现了该蛋白提取液中有六角冰晶形态，而大肠杆菌和磷酸盐缓冲溶液中只有圆形或不规则形状的冰晶。蛋白提取液在低质量浓度下，有双棱锥形状的冰晶；而在较高质量浓度下，有针状冰晶。当质量浓度为0.5 mg/mL时，THA值为0.7℃。Type III型ISPs由几种生活在冰岛上的海洋鱼类中检出，Christopher P等人[7]发现野生Type III型蛋白中具有六角形和双棱锥形状的冰晶，并且能够显著地阻止冰晶的生长。贾弘禔、巩子路等人[8-10]利用单因素试验及响应面分析法分别对白斑狗鱼鱼肉和鱼皮进行分离纯化，并研究了料液比、pH值、不同提取时间和温度下，白斑狗鱼鱼肉和鱼皮THA的变化，通过DSC法测得白斑狗鱼鱼肉的最佳THA达到0.061 2℃，白斑狗鱼鱼皮的最佳THA达到0.072 0℃。

2　昆虫ISPs的抗冻活性检测

昆虫作为变温动物，其生长发育要经受冬季低温的制约。昆虫在长期的进化过程中，已经形成了一系列的适应对策和抗寒机制。例如，有的昆虫能够忍受体内结冰，有的通过降低过冷却点和体内含水量的方法越冬。其中，ISPs的产生是最为重要的低温适应策略之一。许多研究已经表明，不仅在昆虫的体液中，而且在昆虫的肠液和细胞内液中都有ISPs的产生。刘俊杰等人[11]研究甲虫抗冻蛋白是一种具有规则结构的昆虫ISPs，在相同浓度条件下，利用DSC法对其ISPs进行检测，发现其具有比鱼类ISPs更高的抗冻活性。产生ISPs是寒带昆虫抵御低温的重要机制之一，但检测其活性仍存在一些困难，尤其对个体较小的昆虫样品。为了探索DSC法是否适于检测昆虫总蛋白的THA，崔宁宁等人[12]利用DSC法对黄粉虫（Tenebrio molitor）幼虫的总蛋白和血淋巴分别进行了THA检测。结果表明，黄粉虫总蛋白的THA（0.49～0.98℃）要低于血淋巴（2.54～4.34℃）。通过这种方法，进一步检测了3种在内蒙古大兴安岭林区采集到的越冬昆虫：稠李巢蛾（Yponomeuta exonymallus）幼虫、舞毒蛾（Lymantria dispar）卵和落叶松八齿小蠹（Isp subelongatus）成虫。结果发现，它们体内都存在THA，其中稠李巢蛾的THA为（0.34～0.43℃），舞毒蛾的THA为（0.35～0.42℃），落叶松八齿小蠹的THA为（0.37～0.40℃），说明这3种昆虫能以产生ISPs的方式作为越冬策略之一。研究表明，通过DSC法检测昆虫总蛋白是否存在THA来判断ISPs的存在是可行的。Graether S P等人[13]研究发现，20 μmol/L的云杉卷叶蛾ISPs能降低冰点1.08℃，而美洲拟鲽（Pleuronectesamericanus）I型ISPs在浓度到达400 μmol/L时，仅使冰点降低0.27℃。Andrew J S等人[14]研究发现，黄粉虫冰结构蛋白（TmISP）浓度为20 mol/L时能使冰点降低1.4℃，而Ш型鱼类（Oceanpout）ISPs的浓度为218 mol/L时才降低相同的冰点。这些差异既存在于分离的天然ISPs中，也存在于纯化单一成分的重组ISPs或合成ISPs中，因此排除了在体外昆虫ISPs活性的提高是由于其他成分加入的解释[15]。用TmISP与含不同浓度该蛋白的昆虫体液进行Western Blot试验，结果表明THA与ISPs浓度之间的关系呈双曲线型，并且在双曲线斜率变化最大部分的浓度与昆虫体内ISPs的生理浓度非常吻合，这提示昆虫体内ISPs浓度较小的改变就会对其THA造成较大的影响[16]。

3　植物ISPs的抗冻活性检测

到目前为止，被研究的植物材料多达40余种，现已陆续在冬小麦、燕麦、冬黑麦、黑麦草、欧白英、胡萝卜、沙冬青、桃树、唐古特红景天、甜杨等至少26种高等植物中获得具有抗冻活性的ISPs[17]。曲敏等人[1]利用磷酸盐缓冲溶液法提取苜蓿蛋白，经硫酸铵沉淀后，对其透析脱盐、冷冻干燥复溶后进行冰晶形态的观察，可以看到冰晶体积小、数量多、形态多样，说明苜蓿蛋白抑制冰晶生长及对冰晶形态修饰效果显著，具有较好的抗冻活性，为苜蓿ISPs。Chantelle J等人[18]发现，大多数ISPs表现出2种类型的“防冻剂活动”——热滞现象（THA）和抑制冰重结晶活动。检测多年生黑麦草突变体ISPs抑制冰重结晶的活动和热滞现象的关系，发现抑制冰重结晶的活动和热滞现象相关，并在突变体中观察到了形状各异的冰晶形态，能够减少冷冻对细胞的破坏。龚束芳等人[19]以野生偃麦草为原料，选取各个季节的偃麦草根茎提取蛋白，在显微镜下进行观察，观察到冰晶修饰为六角形能力，说明其具有较好的抗冻活性。张超等人[20]以胡萝卜AFP为研究对象，使用DSC法测定THA，对影响样品THA的因素进行全面考察，以建立一个有效测定THA的标准方法。其中，主要研究样品浓度、升降温速率，冰晶含量等因素对样品THA的影响，并考察了该方法的稳定性、重复性和精确度。结果表示，DSC法可以有效地用于样品THA测定。田童童等人[21]在此基础上，使用DSC法测定胡萝卜ISPs的THA。分别对样品质量浓度、升降温速率、冰晶含量等有可能影响其THA的主要因素进行研究，试验结果表明，随着原料质量浓度的升高，THA也逐渐的升高；当质量浓度大于0.5 mg/mL，THA趋向于稳定。缓慢的升温和降温过程导致仪器检测的灵敏度降低，从而导致未能检出THA，由此确定了测定ISPs的THA升降温速率为1℃/min。当样品中冰晶含量的质量分数小于1%时，THA会以幂指函数的形式上升，进一步增加样品中的冰晶含量，THA将会稳定在某一个数值。因此，原料质量浓度、升降温速率、冰晶含量等条件的改变对THA的检测有影响，但目前通过改变条件进行THA检测的研究较少，只是单一的测定其THA值。刘尚等人[22]根据ISPs与冰结合的特性，利用碎冰从女贞（Ligustrum lucidum）叶提取液中分离出抗冻蛋白，利用DSC法对其进行THA测定。结果表明，在0.5 mg/mL的浓度下，冰晶含量为7%时，THA值为0.678℃，说明冰提法提取的女贞叶ISPs抗冻活性较高，接近于鱼类抗冻蛋白。尉姗姗等人[23]利用纤维素DE-52离子柱层析提取分离出了冬季新疆沙冬青（Ammopiptanthus nanus）叶片中的ISPs，用DSC法测定结果表明，当蛋白质量浓度为20 mg/mL时，ISPs的THA为0.46℃。金涛等人[24]利用真空渗透离心法，提取燕麦ISPs工艺的研究，经优化提取工艺所得到的燕麦质外体蛋白质经DSC检测，THA为2.07℃，证明所得蛋白具有明显的热滞活性。

4　细菌与真菌ISPs的抗冻活性检测

目前，细菌、真菌中分离提纯的ISPs种类非常少，仅在南极和北极的少量菌株中发现ISPs。James A.Raymond等人发现香菇、金针菇，以及一些深海冰川中的细菌和硅藻中含有ISPs，并且观察到了形状各异的冰晶形态。也有报道称，冬菇（Flammulina velupites）和牡蛎菇（Pleurotus ostreatus）中存在ISPs[25]。

综上，冰晶和THA是反映冰结构蛋白抗冻活性的2个重要指标，分别从修饰冰晶形态和降低冰点提高热滞差值2个不同层面反应了冰结构蛋白的抗冻活性。一种冰结构蛋白的冰晶形态特点和THA相互关联。对冰结构蛋白的冰晶观察操作简单、冰晶形态直观性强、判断迅速；而对利用DSC检测则准确反映其冰点温度和熔点温度的差异（THA），冰晶含量分析准确。因此，在研究冰结构蛋白的抗冻活性时应从这2个方面进行检测鉴定，建立其抗冻活性的联合检测机制。

参考文献：

[1]曲敏，董正婷，陈凤莲.苜蓿冰结构蛋白的提取及对冷冻面团的影响[J].食品科学，2014，35（24）：57-62.

[2]邵强，李海峰，刘国生，等.抗冻蛋白的抗冻活性及其测定方法[J].平原大学学报，2005，22（4）：111-113.

[3]Celik Y，Graham L A，Mok Y F，et al.Superheating of ice crystals in antifreeze protein solutions[J].P Natl Acard Sci USA，2010，107（12）：5 423-5 428.

[4]Fletcher G L，Hew C L，Davies P L.Antifreeze proteins of teleost fisher[J].Annu Rev Physiol，2001，63（1）：359-390.

[5]张超，赵晓燕，马越，等.使用差示扫描量热仪测定抗冻蛋白热滞活性方法的研究[J].生物物理学报，2008， 24（6）：465-473.

[6]Jong Kyu Lee，Kyoung Sun Park，Seungil Park，et al.An extracellular ice-binding glycoprotein from an arctic psychrophilic yeast[J].Cryobiology，2010（6）：222-228.

[7]Christopher P，Garnhama，Yoshiyuki Nishimiya，et al.Engineering a naturally inactive isoform of type III antifreeze protein into one that can stop the growth of ice[J].FEBS Letters，2012：3 876-3 881.

[8]贾弘禔.生物化学[M].北京：人民卫生出版社，2005：160-184.

[9]巩子路，田童童，张建，等.白斑狗鱼鱼肉中抗冻蛋白的分离纯化[J].中国酿造，2015，34（2）：120-125.

[10]田童童，巩子路，朱新荣，等.白斑狗鱼鱼皮中抗冻蛋白的分离纯化[J].中国酿造，2015，34（4）：72-76.

[11]刘俊杰，李前忠.甲虫抗冻蛋白热滞活性的二维吸附结合模型[J].生物物理学报，2006，22（4）：268-273.

[12]崔宁宁，宋希明，邹元平.应用差示扫描量热法检测昆虫总蛋白的热滞活性[J].昆虫学报，2013，56（2）：131-135.

[13]Graether S P，Sykes B D.Cold survival freeze in tolerant insects：the structure and function of helical antifreeze proteins[J].Eur JBiochem，2004（16）：3 285-3 296.

[14]Andrew J S，Christopher B M，Laurie A G，et al.The basisforhyper-activity of antifreeze proteins[J].Cryobiology，2006，53（2）：229-239.

[15]Wang L，Duman J G.Antifreeze proteins of the beetle Dendroide scanaden sisenhance oneanother's activities[J].Biochemistry，2005（30）：10 305-10 312.

[16]阮功成，曹慧，徐斐，等.不同来源胶原蛋白抗冻活性的研究[J].食品科学，2014，35（17）：22-26.

[17]闫清华，杨理，邵强.抗冻蛋白及其在食品领域中的应用[J].山东农业科学，2010，11（2）：89-92.

[18]Chantelle J，Capicciotti，Jessica S，et al.Modulation of antifreeze activity and the effect upon post-thaw HepG2 gell viability after cryopreservation[J].Cryobiology，2015（1）：6-19.

[19]龚束芳，杨涛，陶洪波.偃麦草根茎蛋白质对冰晶修饰能力的观察[J].东北农业大学学报，2007，38（6）：753-756.

[20]张超，赵晓燕，马越，等.使用差示扫描量热仪测定抗冻蛋白热滞活性方法的研究[J].生物物理学报，2008，24（6）：465-472.

[21]田童童，巩子路，张建.DSC法检测抗冻蛋白的热滞活性的研究[J].中国酿造，2014，33（1）：127-132.

[22]刘尚，廖祥儒，张建国，等.一种女贞叶抗冻蛋白的分离纯化[J].植物学通报，2007，24（4）：505-510.

[23]尉姗姗，尹林克，牟书勇，等.新疆沙冬青抗冻蛋白的提取分离及其热滞活性测定[J].云南植物研究，2007，29（2）：251-255.

[24]金涛，张英，任玮，等.真空渗透离心法提取燕麦抗冻蛋白工艺的研究[J].食品工业科技，2012（23）：267-271.

[25]樊凯凯，刘爱国，陈东，等.冰结构蛋白及其应用研究[J].食品研究与开发，2012，33（9）：221-225.

Advances in Detection of Thermal Hysteresis Activity of Ice Structuring Proteins

CHEN Fenglian，BAO Huan，*QV Min，LI Lingli
（College of Food Engineering，Harbin University of Commerce，College and Vniversties in Heilongjiang Province Key Laboratory of Food Science and Eugineering，Harbin，Heilongjiang 150076，China）

Abstract：In recent years，antifreeze activity detection researched on marine fish，insects，plants，bacteria and fungi.Two kinds of detection method that are ice crystals and thermal hysteresis activity carried on the comprehensive review.Finally，the prospects is put forward to establish joint detection of antifreeze activity of ice structural protein by ice crystal observation and thermal hysteresis activity by differential scanning calorimetry.

Key words：ice structuring proteins；ice crystals；thermal hysteresis activity

中图分类号：TS255.3

文献标志码：A

doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.02.045

文章编号：1671-9646（2016）02b-0056-03

收稿日期：2015-12-21

基金项目：黑龙江省自然科学基金项目（C2011-24）；黑龙江省教育厅科学技术研究项目（12511128）；黑龙江省博士后科研启动基金项目（LBH-Q13098）；2014年哈尔滨商业大学研究生创新科研项目（YJSCX2014-334HSD）。

作者简介：陈凤莲（1975—），女，博士，副教授，研究方向为粮食谷物及其副产品精深加工。

*通讯作者：曲敏（1966—），女，博士，教授，研究方向为食品蛋白与添加剂。