任冠恒，刘宁国，陈忆九，施　妍，邹冬华，黄　平，李正东，邵　煜，邓恺飞（1.南方医科大学基础医学院法医学系，广东广州510515；.司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室，上海00063）



MALDI-TOF-MS对DAI大鼠脑干蛋白质组学的分析

任冠恒1，2，刘宁国2，陈忆九2，施妍2，邹冬华2，黄平2，李正东2，邵煜2，邓恺飞2
（1.南方医科大学基础医学院法医学系，广东广州510515；2.司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室，上海200063）

摘要：目的应用基质辅助激光解吸/电离－飞行时间质谱（matrix－assisted laser desorption/ionization timeof－flight mass spectrometry，MALDI－TOF－MS）技术建立弥漫性轴索损伤（diffuse axonal injury，DAI）诊断模型，筛选DAI相关蛋白或多肽，为寻找DAI的分子标志物提供理论基础。方法将15只雄性SD大鼠随机分为DAI组（n=10）和对照组（n=5），采用MALDI－TOF－MS技术对两组大鼠脑干组织的蛋白或多肽表达谱进行检测，运用ClinProTools 2.2分析软件筛选出具有差异的分子峰，应用遗传算法建立诊断模型。结果筛选出有差异的分子峰61个（P＜0.05），其中DAI组有9个分子峰下调，52个分子峰上调。筛选出5个分子峰建立诊断模型，交叉验证的特异性为96.14%、敏感性为95.98%，盲法验证结果的特异性为73.33%、敏感性为70.00%。结论应用MALDI－TOF－MS技术不仅能够建立特异性和敏感性较高的DAI诊断模型，还可以筛选差异蛋白或多肽，为DAI的法医学鉴定奠定理论基础。

关键词：法医病理学；弥漫性轴索损伤；质谱分析法；基质辅助激光解吸电离；脑干；大鼠

弥漫性轴索损伤（diffuse axonal injury，DAI）是指头部遭受钝性外力作用后所产生以脑白质轴索弥漫性损伤为主要特征的一种脑损伤[1]。在法医学实践中，约80%因交通事故所引起的颅脑损伤存在DAI，约1/3因颅脑损伤死亡的案例与DAI有关[2]。由于DAI以脑白质轴索弥漫性损伤为主要特征，缺乏明确的神经系统损害定位体征以及影像学改变[3]，且DAI的发病机制复杂，造成的后果严重，死亡率和致残率均较高，尸体检验仅凭宏观及一般组织学检查不易诊断，因而DAI不仅是临床上诊治的难点，也是法医学鉴定中面临的难题。

基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱（matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）技术是近年来发展最快的蛋白质组学新技术之一，通过获得生物组织中多肽和蛋白的表达谱，以差异蛋白质组学手段筛选并识别有显著意义的分子标志物，广泛应用于生命科学及医学的各个研究领域[4]。本研究利用MALDI-TOF-MS技术对DAI大鼠和正常大鼠脑干的蛋白质或多肽表达谱进行比较分析，寻找对DAI诊断具有意义的差异性分子，并依据遗传算法建立诊断模型，为DAI的法医学鉴定奠定理论基础。

1材料与方法

1.1实验动物分组与DAI模型制作

15只健康雄性SD大鼠（上海市杰思捷实验动物有限公司提供），体质量200~220g，随机分成DAI组（n=10）和对照组（n=5），用于蛋白或多肽表达谱的质谱检测；25只健康雄性SD大鼠（上海市杰思捷实验动物有限公司提供），体质量200~220g，随机分成DAI组（n=15）和对照组（n=10），用于盲法验证。

DAI组参照Marmarou等[5]的方法制作脑损伤动物模型。用1%苯巴比妥钠溶液以50mg/kg腹腔注射麻醉，生效后去除大鼠头顶部毛发，碘伏常规消毒，在相当于人字缝和矢状缝处作正中切口，分离头皮、骨膜，暴露颅骨，将直径20 mm、厚3 mm的圆形不锈钢垫片粘于头顶正中，将大鼠俯卧固定于已知弹性系数的海绵床上，500g砝码从1m高度由PE管内自由落体垂直打击垫片上，立即移开大鼠以免二次损伤，缝合大鼠头皮，术后动物常规进食进水。对照组大鼠麻醉后仅行头皮切开手术，不进行打击，缝合头皮后常规饲养。

1.2染色及质谱检测

1.2.1切片制备和染色

损伤24 h后，大鼠用1%苯巴比妥溶液麻醉，经心穿刺放血致死，解剖获得脑组织，用铝箔松软包裹，在-20℃冷冻30 s后，立即转移至-80℃冰箱中保存至冰冻切片。

切片时，提取大鼠脑干组织，作矢状面切开，将脑干组织矢状面朝上用OCT冰冻切片包埋剂固封根部，并固定于CM 1950低温恒温器（德国Leica公司）的切割平台上，连续切片后进行HE染色和银染。供MALDI-TOF-MS检测的切片自然快速地融裱在导电玻片上，然后将导电玻片转入真空干燥器，抽气以去除切片中的水分。然后分别用70%、90%、100%的乙醇溶液各浸洗玻片30s，以除去盐类和小分子脂质等干扰成分，再将玻片转入真空干燥器干燥。

1.2.2基质覆盖

称取适量SA基质，以V（乙腈）∶V（水）=6∶4为溶剂，配制成质量浓度为10mg/mL的基质溶液（含0.2%三氟乙酸）。用ImagePrep自动基质喷雾装置（德国Bruker公司）将基质溶液均匀喷于组织切片上。

1.2.3质谱检测

用扫描仪扫描融裱有组织切片的靶盘图片，将其导入成像软件FlexImaging 3.0（德国Bruker公司）中，手动定义激光的扫描区域。将制备好的样品靶通过AutoFlexⅢMALDI-TOF质谱仪（德国Bruker公司）检测口放入质谱仪内部托盘并固定。启动激光系统提供脉冲激光，打击样品靶点，通过FlexControl 3.0软件（德国Bruker公司）设置仪器参数，采用正离子模式和线性模式，激光频率200 Hz，能量范围44%，在质荷比1 000~20 000范围内扫描和采集数据。采用ClinProTools 2.2软件（德国Bruker公司）对质谱图进行平滑、对齐、归一化等处理。

1.3统计学分析

利用ClinProTools 2.2软件对数据进行统计学处理，两组间比较采用t检验，检验水准α=0.05。把差异分子峰通过遗传算法进行优化选择，建立诊断模型，采用盲法对未知的25个样本进行验证。

2结　果

2.1 HE染色和银染结果

HE染色：DAI组脑干组织结构疏松，广泛性淤血、水肿，神经元变性水肿，脑实质内偶见灶性出血（图1A）；对照组未见异常。

银染：DAI组可见脑干神经轴索不规则增粗、肿胀、断裂及收缩球形成，排列稀疏（图1B）；对照组未见异常。

2.2 MALDI－TOF－MS检测结果

DAI组和对照组的平均质谱图见图2，质荷比（m/z）在1 000～20 000范围内，DAI组与对照组有差异的分子峰为61个（P＜0.05，表1），与对照组相比，DAI组有9个分子峰下调，52个分子峰上调。利用遗传算法对61个差异分子峰进行模型运算，筛选出两组中符合条件的5个差异分子峰，质荷比分别为1279.52、1951.16、3164.80、12342.10及14125.01，其中1279.52、3 164.80、12 342.10及14 125.01差异分子峰在DAI组中高表达，而1951.16差异分子峰在DAI组中低表达，建立诊断模型（表2），交叉验证的特异性为96.14%，敏感性为95.98%。

2.3诊断模型盲法验证

运用遗传算法建立模型后，调入未经模型识别的15例大鼠DAI脑干样本和10例正常脑干样本的数据，利用建成的模型对其进行分类，分类结果显示，诊断DAI的敏感性为73.33%（11/15），特异性为70.00% （7/10）。

表1 DAI组的61个差异分子峰　　（±s）

表1 DAI组的61个差异分子峰　　（±s）

蛋白平均强度峰序号质荷比蛋白平均强度DAI组（n=10）2　 1139.44 6.36±1.20 4.88±1.28 　 27　 4321.52 0.89±0.19 1.30±0.25 　 49　 8726.48 0.29±0.11 0.35±0.10 3　 1173.83 13.04±5.88 4.59±0.94　 28　 4466.07 0.85±0.19 1.30±0.28　 50　 8950.94 0.54±0.33 1.33±0.84 4　 1207.74 10.48±2.82 6.26±1.65　 29　 4714.93 0.95±0.22 1.37±0.27　 51　 9215.99 0.45±0.20 0.81±0.26 5　 1279.52 4.52±1.14 5.71±1.64　 30　 4860.72 0.77±0.18 1.05±0.22　 52　 9981.82 0.77±0.54 2.97±2.16 6　 1403.07 6.84±2.40 3.59±0.59　 32　 5162.89 0.70±0.18 1.03±0.22　 53　 10190.69 0.14±0.04 0.31±0.14 7　 1439.28 10.58±4.05 4.23±1.31　 33　 5301.62 0.64±0.18 1.03±0.25　 54　 10654.19 0.09±0.03 0.19±0.09 9　 1665.85 6.79±2.14 2.99±0.43　 34　 5405.23 0.56±0.14 0.87±0.20　 55　 10800.17 0.10±0.03 0.18±0.07 10　 1895.88 3.93±0.86 2.22±0.36　 35　 5498.59 0.73±0.29 0.92±0.29　 56　 11329.33 0.09±0.03 0.17±0.08 11　 1951.16 3.53±0.54 2.56±0.42　 36　 5641.28 1.11±0.50 1.90±0.90　 57　 11982.05 0.12±0.07 0.26±0.12 12　 2207.12 2.61±0.34 2.28±0.33　 37　 5920.17 0.47±0.13 0.69±0.16　 58　 12141.33 0.13±0.07 0.61±0.62 15　 2595.50 1.77±0.25 1.90±0.29　 38　 6081.35 0.43±0.11 0.78±0.22　 59　 12342.10 0.08±0.04 0.19±0.08 17　 2825.79 1.63±0.24 1.88±0.29　 39　 6165.51 0.54±0.15 0.80±0.19　 60　 12955.49 0.08±0.02 0.18±0.11 18　 2956.53 1.54±0.23 1.65±0.23　 40　 6542.84 0.36±0.09 0.61±0.14　 61　 14125.01 5.47±3.43 9.85±4.38 19　 3019.77 1.48±0.22 1.69±0.26　 41　 6729.13 0.39±0.11 0.59±0.18　 62　 15182.57 0.11±0.05 0.52±0.63 20　 3164.80 1.45±0.22 1.72±0.27　 42　 7075.78 2.56±1.20 3.95±1.33　 63　 15845.77 0.08±0.03 0.22±0.19 21　 3374.07 1.24±0.20 1.50±0.26　 43　 7597.74 0.29±0.07 0.55±0.15　 64　 16257.16 0.07±0.03 0.16±0.07 22　 3533.02 1.21±0.22 1.53±0.29　 44　 7862.45 0.26±0.09 0.39±0.10　 65　 17156.10 0.09±0.04 0.16±0.09 23　 3670.93 1.14±0.23 1.44±0.27　 45　 8059.30 0.23±0.07 0.37±0.10　 67　 18393.34 0.36±0.24 0.63±0.32 24　 3829.29 1.12±0.26 1.54±0.31　 46　 8245.28 0.19±0.05 0.33±0.09　 68　 19510.04 0.05±0.02 0.11±0.06 25　 3936.63 0.95±0.19 1.27±0.26　 47　 8352.88 0.20±0.06 0.33±0.09 26　 4209.38 0.86±0.17 1.19±0.24　 48　 8578.80 0.45±0.19 0.78±0.54蛋白平均强度对照组（n=5）DAI组（n=10）峰序号质荷比　对照组（n=5）DAI组（n=10）峰序号　质荷比　对照组（n=5）

表2遗传算法优化选择筛选出符合条件的5个差异分子峰　　（n=15）

3讨　论

作为头部遭受钝性外力作用的重要后果之一，DAI近年来日益得到法医病理学界的重视。目前研究认为，DAI发生机制及病理改变为脑组织各部位间遭受不均一变速及旋转作用后产生的剪切应力作用，使脑组织在受压及回位过程中产生相对运动，导致神经轴索发生广泛的变形、断裂并出现特征性轴索收缩球[6]。轴索收缩球是诊断DAI的可靠依据，目前普遍认为，轴索收缩球的形成至少需要12～24h[7]。本研究在大鼠DAI损伤后24h利用银染法观察到收缩球。

分子标志物的发展和应用已有一百多年的历史。目前，最广泛用于诊断DAI的分子标志物是β－淀粉样前体蛋白（β－amyloid precursor protein，β－APP）、核转录因子（nuclear factor，NF）、Homer1、S100BB、髓磷脂碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）[8－12]等。生物分子标志物的检测常用酶联免疫吸附试验（ELISA）、化学发光免疫分析（CLIA）等方法[13]，但关于DAI早期诊断的问题至今尚未解决，原因是这些分子标志物的敏感性和特异性均较低。近年来，蛋白质组学技术的快速发展给分子标志物的发现带来了新的机遇，该技术能够从整体分析组织的蛋白表达谱，有望发现一组相关的蛋白质或多肽代替单一分子标志物以达到早期诊断的目的[14]。

MALDI－TOF－MS是蛋白质研究技术常用方法之一[15]，对损伤区直接扫描，利用质谱快速、敏感的分辨能力完成对损伤区蛋白质谱的整体收集，利用计算机技术的强大数据分析能力比较损伤区组织与正常组织间蛋白表达差异，具有高通量、高灵敏度和高精度的特点[16]。

本研究利用MALDI－TOF－MS技术，联合应用ClinProTools 2.2分析软件，通过对DAI大鼠和正常大鼠脑干组织的蛋白和多肽指纹图谱进行分析，筛选出具有统计学意义的差异分子峰61个（P＜0.05，表1），与对照组相比，DAI组中有9个分子峰出现低表达，52个分子峰高表达。DAI的发生发展导致了这些蛋白或多肽的上调和下调，DAI的发生发展除了外力直接引起原发性轴索损伤外，损伤数小时后还可引起继发性轴索损伤，这与细胞钙超载有着直接的关系[17]。这些蛋白或多肽的表达增多可能通过调节钙释放，参与损伤和修复的过程。而蛋白或多肽的表达下调可能与DAI后体内蛋白质或多肽降解有关。这些蛋白或多肽的上调和下调对于了解DAI的机制有一定意义，而且筛选出的61个差异分子有可能成为DAI的潜在标志物。Li等[18]报道MBP是脑白质中含量最丰富的蛋白之一，MBP的N末端降解产物在脑损伤发生2h后迅速增加，1～2d达到高峰，其相对分子质量分别为8 000和10 000，从表1中可以找到两个m/z分别为8059.30和10190.69的分子峰，且这两个分子峰均表达上调，很可能为MBP的N末端降解产物。这两个分子峰虽然没有选入最终的诊断模型，但这两个峰显示出了显著的差异性和特异性，可以作为DAI的重要分子标志物。

采用遗传算法对两组数据进行组合优化，筛选多个差异分子峰建立DAI的诊断模型，该诊断模型具有较高的敏感性和特异性。遗传算法建立的诊断模型，与当前蛋白质组学研究所提出的利用几种蛋白质联合进行诊断的原理相一致。

本研究说明，利用MALDI－TOF－MS在组织病理学和蛋白质组学方面的新技术，以差异蛋白质组学手段对比研究DAI前后蛋白质或多肽表达谱的变化，能同时快速地筛选出多种差异分子，不仅可以发现一些上调或下调的蛋白质或多肽，而且对进一步了解这些蛋白质或多肽的互相作用及其与外周环境的关系，从而为深入探讨DAI的发生机制提供依据。因此，MALDI－TOF－MS技术对于拓展传统病理形态学研究领域，丰富法医病理学研究方法必将有很大帮助。

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（本文编辑：黄平）

书讯

《视觉功能检查及客观评定的法医学原则与方法》由司法部司法鉴定科学技术研究所王萌、夏文涛与中国政法大学证据科学研究院王旭共同主编。本书侧重于眼外伤鉴定中视觉功能障碍评定这一公认的难点问题，围绕“十二·五”国家科技支撑计划项目目标与任务，重点探讨了视觉功能障碍的实验室检验技术方法与结果评价原则，强调检验与评价的规范性、一致性，有助于司法鉴定相关实验室的建设与质量控制活动，对视觉功能障碍的法医临床学鉴定具有重要的指导意义。

全书共分七章，涵盖了视力、视野等视觉功能心理物理学检查、眼球结构的一般检查与特殊辅助检查、伪盲、伪装视力降低与夸大视野缺损的心理物理学及其视觉电生理检查，还包括了目前在法医临床学鉴定实践中尚未广泛应用的微视野技术、多焦视觉电生理技术等内容。在实验室检验技术介绍的同时，重点阐述了基本原理与作者所在研究团队的研究成果，可供读者在鉴定与研究中借鉴、参考。

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Proteomic Analysis of Rat Brain Stem with DAI by MALDI-TOF-MS

REN Guan-heng1,2, LIU Ning-guo2, CHEN Yi-jiu2, SHI Yan2, ZOU Dong-hua2, HUANG Ping2, LI Zhengdong2, SHAO Yu2, DENG Kai-fei2
（1. Department of Forensic Science, School of Basic Medicine Science, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China; 2. Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine, Institute of Forensic Science, Ministry of Justice, P.R.China, Shanghai 200063, China）

Abstract：Objective To establish a diagnostic model for diffuse axonal injury（DAI）by matrix－assisted laser desorption/ionization time－of－flight mass spectrometry（MALDI－TOF－MS）. To screen the proteins or peptides associated with DAI for providing the biomarkers with theoretic foundation. Methods Fifteen male Sprague－Dawley rats were randomly divided into DAI group（n=10）and control group（n=5）. The protein or peptide expression profiles of rat brain stem were detected by MALDI－TOF－MS. ClinProTools 2.2 software was used to find specific peaks, and a diagnostic model was established by the genetic algorithm. Results There were significant differences in 61 peaks of DAI group（P＜0.05）, 9 peaks were down－regulated and 52 up－regulated. The diagnostic model was established based on 5 different peaks. The specificity and sensitivity of cross validation was 96.14% and 95.98%; while the specificity and sensitivity of blind validation showed was 73.33% and 70.00%, respectively. Conclusion A specific and sensitive diagnostic model of DAI can be established by MALDI－TOF－MS to provide a potential value for determining DAI in forensic practice.

Key words：forensic pathology; diffuse axonal injury; mass spectrometry; matrix－assisted laser desorption－ionization; brain stem; rats

收稿日期：（2015-12-17）

通信作者：刘宁国，男，研究员，主任法医师，主要从事法医病理学研究；E－mail：liuningguo@foxmail.com 陈忆九，男，研究员，博士研究生导师，主要从事法医病理学研究；E－mail：chenyj@ssfid.cn

作者简介：任冠恒（1990—），女，硕士研究生，主要从事法医病理学研究；E－mail：rgh_0101@163.com

基金项目：中央级科研院所科研专项（GY2013Z－3、GY2015G－2）

文章编号：1004－5619（2016）01－0013－05

中图分类号：DF795.1

文献标志码：A

doi：10.3969/j.issn.1004－5619.2016.01.003