吴辉 陈晓光 魏丹 苏曼莉 姚汉云 刘慧 王淼

〔摘要〕 目的 观察单味中药白芷、吴茱萸、川芎对偏头痛模型大鼠神经递质及脑干C-FOS表达的影响。方法 将48只Wistar大鼠随机分为6组（每组8只）：空白组、模型组、白芷治疗组、吴茱萸治疗组、川芎治疗组、西比灵治疗组（药物对照）。各治疗组分别按0.79 g/kg、0.40 g/kg、0.79 g/kg、0.43 mg/kg干预，模型及空白组灌胃相同体积生理盐水，连续7 d。除空白组外，均于末次灌胃1 h后，硝酸甘油10 mg/kg皮下注射方法制备大鼠偏头痛模型。4 h时采血，ELISA法检测血清脑啡肽（Enkephalin， ENK）、β内啡肽（β-Endorphin， β-EP）含量;免疫组化方法检测脑干组织C-FOS表达;并观察各组大鼠行为学表现。结果 与空白组比较，模型组动物血清ENK含量显著增高（P<0.05），血清β-EP含量显著降低（P<0.05）;与模型组比较，各治疗组ENK含量及C-FOS表达降低（P<0.05），β-EP含量显著增高（P<0.05）;川芎组ENK含量低于白芷组（P<0.05），川芎组C-FOS表达低于吴茱萸组（P<0.05）。结论 3种中药均能改善偏头痛动物双耳变红、挠头、爬笼、竖耳、皮肤发绀等行为学表现，减少ENK分泌，增加β-EP含量，降低C-FOS表达。

〔关键词〕 偏头痛;川芎;白芷;吴茱萸;C-FOS;脑干

〔中图分类号〕R285.5&nbsp;      〔文献标志碼〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.06.009

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of single traditional Chinese medicine （TCM）-Radix Angelicae Dahuricae， Fructus Evodiae and Rhizoma Chuanxiong on neurotransmitters and the expression of C-FOS in the brainstem of migraine model rats. Methods A total of 48 Wistar rats were randomly divided into 6 groups （each group of 8 rats）： a blank group， a model group， a Radix Angelicae Dahuricae group （BZ group， 0.79 g/kg）， a Fructus Evodiae group （WZY group， 0.40 g/kg）， a Rhizoma Chuanxiong group （CX group， 0.79 g/kg） and a drug control group （XBL group， 0.43 mg/kg）. Each treatment group was given its respective medicine， while the blank group and the model group were given the same volume of normal saline by gavage， for 7 d. Except for the blank group， the rat model of migraine was prepared by subcutaneous injection of nitroglycerin 10 mg/kg at 1 h after the last gavage. At the end of 4 h， blood was collected. The content of enkephalin （ENK） and β-endorphin （β-EP） in serum was tested by ELISA， and the expression of C-FOS in brainstem was detected by immunohistochemistry （IHC）. And the behavior of each group of rats was observed. Results Compared with the blank group， the content of ENK in serum in the model group was significantly increased （P<0.05）， and the content of β-EP in serum was significantly decreased （P<0.05）. Compared with the model group， the content of ENK and the expression of C-FOS in each treatment group were decreased obviously （P<0.05）， and the content of β-EP was increased significantly （P<0.05）. The ENK content of the CX group was lower than that in the BZ group （P<0.05）， and the C-FOS expression of the CX group was lower than that in the WZY group （P<0.05）. Conclusion The 3 kinds of TCM can improve the behavioral performance of migraine animals such as red ears， head scratching， climbing cage， erect ears and cyanosis， reduce the secretion of ENK， increase the content of β-EP and decrease the expression of C-FOS.

〔Keywords〕 migraine; Rhizoma Chuanxiong; Radix Angelicae Dahuricae; Fructus Evodiae; C-FOS; brainstem

偏头痛（Migraine）是一种反复发作的血管性头痛，呈一侧或两侧疼痛，常伴恶心、呕吐、畏光等症状。少数典型者发作前有视觉、感觉和运动等先兆，可有家族史。2010年我国原发性头痛流行病学调查显示，偏头痛发病率为9.3%。日本偏头痛患病率为6.0%～8.4%，美国与欧洲约为12%[1]。30岁以下年龄组发病率有逐年增多的趋势[2]。

偏头痛属于中医学“头痛”范畴。中医药治疗本病经验丰富，教材《中医内科学》《中药学》在论及头痛、偏头风的治疗时均用到川芎、白芷、吴茱萸，但没有说明三者功效的差别，仅有“头痛不离川芎”之说，似乎川芎治疗头痛效果最好，但无明确说明。本实验利用硝酸甘油（Glyceryltrinitrate， GTN）制备大鼠Migraine模型，观察三种中药对脑啡肽（Enkephalin，ENK）、β内啡肽（β-Endorphin， β-EP）含量及脑干组织C-FOS表达的影响，了解三者之间的疗效差异，指导临床用药。

1 材料与方法

1.1  实验动物

Wistar大鼠48只，雌雄各半（200±10）g，购于湖北省动物中心，动物合格证编号：42000600012121。动物实验在武汉市第一医院屏障动物室内进行，动物设施使用证编号：00137527。动物室内12 h昼夜交替，实验动物饲喂维持饲料（北京华阜康公司），自由饮去离子水。

1.2  实验药物

白芷、吴茱萸、川芎购于武汉市第一医院中药房，由湖北天济中药饮片有限公司炮制、包装，批号分别为20150912、20150921、201510022。单味中药浸泡30 min后，大火煎开，改小火30 min，双层纱布过滤;再加水煎煮一次，合并2次滤液，分别浓缩至0.67 g/mL、0.50 g/mL、0.67 g/mL，4 ℃冰箱保存备用;硝酸甘油由河南润弘制药股份有限公司生产，批号1503302，5 mg/mL;盐酸氟桂利嗪胶囊（西比灵）由西安杨森生产，批号150424975，5 mg/粒。

1.3  仪器及试剂

1.3.1  仪器  MK3型酶标仪（美国热电）;动物室监控系统（SONY-GEDVR-WTO）;千屏显微图像采集系统（武汉千屏）。

1.3.2  試剂  ENK、β-EP等指标ELISA检测试剂盒购于上海酶联生物科技有限公司（批号分别为10-61-499，10-61-497），组化用兔抗大鼠一抗C-fos（Bioworld， BS6433），组化检测试剂盒（Servicebio，G1210，含二抗），水合氯醛（上海山浦化工有限公司，AR，批号20150312）。

1.4  分组及干预

48只大鼠随机分为6组，每组8只（雌雄各半），分别为：模型组与空白组分别灌胃2 mL生理盐水，白芷组按0.79 g/kg质量灌胃白芷煎煮液（按人与大鼠体表面积换算）2 mL、吴茱萸组按0.40 g/kg体质量灌胃吴茱萸煎煮液2 mL、川芎组按0.79 g/kg体质量灌胃川芎2 mL、西比灵组按0.43 mg/kg体质量灌胃西比灵混悬液2 mL，连续7 d;在第7天灌胃1 h后，空白组皮下注射生理盐水，其他各组均按10 mg/kg剂量皮下注射硝酸甘油[3]。

1.5  指标检测

1.5.1  行为学观察  从造模时起，利用动物室监控系统，于注射硝酸甘油后连续摄录3 h内各动物的行为（包括耳朵变红、挠头、甩头、爬笼、竖耳、竖毛、皮肤发绀等现象）。每30分钟为1个时间段，观察摄录资料中各组动物双耳红出现时间及观察时间段内动物挠头次数。挠头开始时间以大鼠挠头次数>5次以上次为标志，消失时间以挠头次数<5次并出现倦怠表现为标志[4]。

1.5.2  血清ENK、β-EP含量检测  注射硝酸甘油后4 h以10%水合氯醛腹腔注射麻醉动物，腹主动脉采血（分离胶管盛装），分离胶管于室温放置2 h，3 000 r/min离心10 min，分离血清，-80 ℃冰箱保存。采用酶联免疫吸附法（ELISA）按试剂盒说明书操作方法来检测各组动物血清ENK、β-EP含量。

1.5.3  脑干组织免疫组化检测  4%多聚甲醛固定脑干组织经常规方法包埋，将所切白片置于58 ℃烤片1 h;恢复室温后将样本脱蜡至水;微波加热进行抗原修复;滴加3%双氧水于玻片上孵育10 min消除内源性过氧化物酶活性，再以双蒸水清洗3次，每次3 min;滴加正常山羊血清室温下孵育12 min;滴加1∶80稀释一抗（C-FOS），于湿盒中4 ℃孵育过夜;取出湿盒室温放置20 min，PBS浸洗3次，每次3 min;滴加生物素标记二抗，室温孵育30 min;PBS浸洗3次，每次3 min，滴加辣根酶标记链霉卵白素，室温孵育30 min;PBS冲洗3次，每次5 min;新鲜配制DAB染色30 min，流水冲洗2 min;苏木素复染，盐酸酒精返蓝;自来水冲洗后脱水，中性树胶封片，显微镜下观察，胞浆棕褐色为阳性表达。用IPP 6.0软件计算各组阳性表达OD值，并与空白组比较计算各组相对表达量。

1.6  统计分析

用SPSS 19.0 统计软件进行数据处理。数据以“x±s”表示，实验数据用单因素方差分析进行统计。如果方差齐性，即用最小显著差数法（LSD）完成组间比较，如果方差不齐，则用Dunnett's T3进行比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1  各组动物行为学改变

模型组动物在3 min左右出现双耳发红、上肢挠头频繁、烦躁、爬笼次数增加等现象，1～3 h后，现倦怠、活动减少等症状。空白组未见双耳发红，仅偶尔出现挠头、爬笼现象。如表1所示，各组动物耳红出现时间差异无统计学意义（P=0.831）。

2.2  各组动物不同时间段挠头次数比较

如表1所见，与空白组比较，模型组各时间段挠头次数均显著增高（P=0.000）;与模型组比较，各个时间段3组中药组挠头次数均显著降低（P=0.000），西比灵组31～60 min段、61～90 min段、91～120 min段、121～150 min时间段挠头次数显著降低（P值分别为0.000，0.000，0.000，0.000，0.029）;与川芎组比较，0～30 min时间段白芷组和吴茱萸组挠头次数均显著增高（P值分别为0.001，0.000），91～120 min时间段吴茱萸组挠头次数显著降低（P=0.004），在31～60 min、61～90 min及151～180 min时间段白芷组挠头次数均显著增高（P=0.000，0.007，0.020）。

2.3  各组动物血清ENK、β-EP含量比较

与空白组比较，模型组血清ENK含量显著增高（P=0.004），β-EP含量显著降低（P=0.002）;与模型组比较白芷组、吴茱萸、西比灵组ENK含量降低（P值分别为0.000，0.001，0.026），白芷组B-EP含量显著增高（P=0.001）;与西比灵组比较，白芷组ENK含量显著降低（P=0.036），白芷组、吴茱萸组、川芎组B-EP含量均显著增高（P值分别为0.000，0.004，0.003）;与川芎组比较，白芷组ENK含量显著降低（P=0.011），白芷组β-EP含量显著增高（P=0.026），见表2。

2.4  各组动物脑干C-FOS表达比较

各组之间C-FOS表达有显著差异（方差分别为6.327，P=0.021），进一步两两比较结果显示，与空白组比较，模型组C-FOS表达显著增高（P=0.033）;与模型组比较，各个治疗组C-FOS表达均显著降低（P值分别为0.002，0.025，0.005，0.039）;与西比灵组比较，白芷组C-FOS表达显著降低（P=0.042）;川芎组C-FOS表达显著低于吴茱萸组（P=0.041），见表2、图1。

3 讨论

偏头痛是临床常见的一种慢性神经血管病，具有无法根治、反复发作并容易伴有精神障碍等特点，对患者生活质量影响巨大。大多数患者发病时会影响学习或工作。世界卫生组织（WTO）发布的常见疾病按健康寿命损失年（years lived with disability， YLD）排列中，偏头痛位列第20位，且将严重偏头痛定为最严重致残的慢性疾病，等同于痴呆、瘫痪和严重精神病[5]。因此防治偏头痛是亟待解决的公共健康课题。

阿片肽系统是参与高级中枢对伤害性刺激内源性调节的相关递质之一，是控制痛觉的主要递质，其中ENK和β-EP在脑内和脊髓内均有镇痛作用，β-EP在脑内含量远远大于脊髓，ENK在脊髓发挥镇痛作用，而在脑内反而有对抗吗啡镇痛作用。β-内啡肽由31个氨基酸组成，主要在垂体合成，是β脂肪酸释放激素的第36～91氨基酸序列，存在于丘脑、垂体、肾上腺及其他外周组织中。有研究认为偏头痛是由于伤害感受系统的神经递质功能失调引起的，β-内啡肽是其中最重要的神经递质[6]，β-EP释放减少时，其抑制去甲肾上腺素神经元胞体活性的能力下降导致颈部血管收缩舒张失调，造成同侧颈内动脉收缩和颈外动脉舒张，与偏头痛的前驱期和头痛期血管变化一致[7]，因此认为β-EP具有缓解偏头痛的作用。

C-FOS基因属于即刻早期基因，对神经递质、激素、神经冲动及外界刺激引起的传入信息在数分钟内即可做出反应并进行表达，作为神经元激活的标志物，是细胞外刺激、激活神经元的敏感指标，并广泛用于多种疼痛研究。正常情况下，C-FOS很少表达，各种如疼痛、创伤等伤害性刺激均可诱导中枢神经系统C-FOS表达，其表达水平与痛觉调控密切相关。FOS蛋白与JUN蛋白在胞核中相互连接形成二聚体复合物，并结合目的基因中的AP-1位点，进一步激活目的基因表达最终对疼痛刺激作出反应[8-10]。

中医学认为，偏头痛属于“偏头风”“头风”“脑痛”“偏头痛”等范畴，系由风邪、气郁、肝阳上扰或痰浊、淤血阻滞脑络，不通则痛，发为本病。通过对《中医方剂大辞典》中治疗头痛、偏头痛方剂的分析发现，白芷-川芎组合出现的頻率最高，其机制与抗炎及能量代谢相关通路有关[11]。川芎是治头痛要药，现代药理研究也证实川芎中挥发油成分有镇痛作用[12]，白芷能祛风止痛，善治头面部的疼痛，这二味药在1994-2007年中药治疗偏头痛的文献分析中属于高频率使用药物[13];吴茱萸为治疗肝寒气滞诸痛主药，《伤寒论·辨厥阴病脉证并治》：“干呕，吐涎沫，头痛者，吴茱萸汤主之。”

本研究显示，偏头痛模型组及各治疗组大鼠皮下注射硝酸甘油约4 min时双耳变红，继而出现烦躁、活动增多，前肢及后肢搔头频繁，中药治疗组及西比灵治疗组动物烦躁、挠头次数较模型组少，三种中药组在90 min左右时搔头减少，120 min后逐渐开始倦卧，期间有间断活动。在皮下注射硝酸甘油后动物血清ENK含量增高，β-EP含量降低，脑干组织C-FOS表达增高，川芎治疗组ENK含量显著低于白芷组（P<0.05），β-EP含量高于白芷组（P<0.01），C-FOS表达低于吴茱萸组（P<0.05）。从各组动物行为改变看，开始阶段川芎治疗组挠头次数最低，且维持时间较长;吴茱萸组挠头次数梯次降低较快，提示川芎、吴茱萸可能联用疗效较好。

参考文献

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