王兴红,李红叶

(1.中国林业科学研究院 华北林业实验中心,北京　102300;2.浙江大学 农业与生物技术学院,浙江 杭州　310058)



柑橘叶点霉菌ISSR-PCR反应体系的优化

王兴红1,李红叶2

(1.中国林业科学研究院 华北林业实验中心,北京102300;2.浙江大学 农业与生物技术学院,浙江 杭州310058)

摘要：为了获得最优柑橘黑斑病病原菌柑橘叶点霉菌 ISSR-PCR反应体系,利用单因素试验法对反应体系中的5个因素(Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶和模板DNA)分别设置了不同的浓度梯度进行反应体系的优化。结果表明,在20 μL反应体系中,含有1.5 mmol/L的Mg2+、0.15 mmol/L的dNTP、0.3 μmol/L的引物、25 ng DNA模板、0.5 U Taq DNA聚合酶为最优。利用优化的ISSR-PCR反应体系对不同地理来源的21株柑橘叶点霉菌菌株进行扩增。结果表明,已建立的体系稳定可靠。柑橘叶点霉菌ISSR-PCR反应体系的建立为利用ISSR分子标记技术对柑橘叶点霉菌进行遗传分析奠定了基础。

关键词：柑橘叶点霉菌;ISSR;单因素试验法;柑橘黑斑病

柑橘是世界第一大水果,我国是柑橘的重要原产地之一,种植面积和产量均居世界首位[1]。由柑橘叶点霉菌(Phyllostictacitricarpa)(有性态为GuignardiacitricarpaKiely)引起的柑橘黑斑病是我国柑橘的主要病害之一,该病菌主要侵染幼果,潜伏期长,一般待果实接近成熟才表现症状[2],果实受害严重时易脱落,不脱落果实因果皮上的病斑难以销售。柑橘黑斑病主要分布在亚洲、澳大利亚、南美洲、南非等柑橘产区[3],在欧盟地区尚未发现该病害存在,因此黑斑病被欧盟列为A1类检疫对象[4],带病果实无法出口欧盟等多个国家。作者的前期研究发现,在我国柑橘叶点霉菌主要危害宽皮柑橘(Citrusreticulata)、甜橙(Citrussinensis)和柠檬(Citruslimon),而柚类果实上的褐斑病的病原则是亚洲柑橘叶点霉菌[5]。……