郭子平,翟清华,曾令锋,邓西平,杨淑慎

(1.西北农林科技大学 生命科学学院,陕西 杨凌　712100;2.西北农林科技大学 黄土高原土壤侵蚀与旱地农业国家重点实验室,陕西 杨凌　712100)



小麦TaGAPC定点突变体基因载体构建及其原核表达

郭子平1,翟清华1,曾令锋1,邓西平2,杨淑慎1

(1.西北农林科技大学 生命科学学院,陕西 杨凌712100;2.西北农林科技大学 黄土高原土壤侵蚀与旱地农业国家重点实验室,陕西 杨凌712100)

摘要：为了研究催化活性半胱氨酸Cys154、Cys158残基对小麦细胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶(TaGAPC)蛋白酶活性的影响,利用重叠延伸PCR法分别将这2个位点的半胱氨酸突变成丝氨酸,并分别连入pET28a(+)原核表达载体。在25 ℃条件下，TaGAPC及其定点基因TaCys154S/TaCys158S经0.25 mmol/L IPTG诱导后高效表达,SDS-PAGE电泳检测结果显示,目标重组蛋白均为可溶性且大小约为40 kDa,与预测结果一致。在此基础上,经超声波破菌及镍柱纯化获得3种纯化重组蛋白。这为后续TaGAPC及其定点突变体蛋白酶活性测定及活性位点分析提供试验材料。

关键词：TaGAPC;重叠延伸PCR;定点突变;原核表达;蛋白纯化

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作为糖酵解反应的一种关键酶,在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(辅酶Ⅰ)和无机磷酸盐存在的情况下,催化3-磷酸-甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油醛[1]。GAPDH普遍存在于原核和真核生物中,具有高度种属保守序列[2-3]。长期以来,GAPDH由于在同种组织或细胞中相对恒定的表达量,所以一直被当作“管家基因”和内参[4]。然而近年来大量研究发现,GAPDH除参与糖酵解反应外,还参与许多其他代谢过程,是一种多功能蛋白质。……