郭海燕，张 昊，李拥军，程国虎

(扬州大学动物科学与技术学院，江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室，江苏扬州 225009)



性别控制技术及其在家畜生产中的应用

郭海燕，张 昊，李拥军*，程国虎

(扬州大学动物科学与技术学院，江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室，江苏扬州 225009)

繁殖力是畜牧生产中重要的经济指标，繁殖新技术对畜禽生产与繁殖起着巨大的推动作用。性别控制技术是繁殖新技术发展史上的一个重要里程碑。对性别控制技术及其在家畜生产中的应用进行了综述。

繁殖力；性别控制；家畜生产

繁殖力是评价家畜经济效益的重要指标，对种畜而言繁殖力就是生产力。因此，提高家畜的繁殖性能对于提高我国畜牧业的经济效益具有重要意义。随着科学技术的发展，繁殖新技术在畜牧生产中的应用越来越广泛，并取得了一定的成果。动物繁殖新技术包括性别控制、动物克隆、转基因技术、胚胎嵌合以及体外受精等。性别控制技术是繁殖新技术发展史上的一个重要里程碑。笔者对性别控制技术及其在家畜生产中的应用进行了综述。

1　性别控制技术

性别控制(Sex control)是指通过人为干预并按照人们的愿望使雌性动物繁殖出所需性别后代的一种繁殖新技术。性别控制技术在畜牧生产实践中有着重要的意义。性别控制技术可使受性别限制的生产性状(如泌乳性状)和受性别影响的生产性状(如生长速度、肉质等)获得更大的经济效益；同时，还能增强良种选种中的强度和提高育种效率，以获得最大的遗传进展。此外，通过控制性别还能克服牛胚胎移植中出现的异性孪生不育现象，排除伴性有害基因的危害等[1]。

1.1性别控制技术的发展基础公元前400年，古希腊哲学家德谟克利特就提出通过抑制一侧睾丸从而控制后代性别的设想，虽然这设想在现在看来十分荒谬，但也反映出当时人们对性别控制技术的渴望。1923年，Painter首次证实了人类X和Y染色体的存在，并指出卵子与Y精子结合时发育为雄性，与X精子结合时发育为雌性。1959年，Welshons和Jacobs等提出Y染色体决定雄性的理论。1990年，Sinclair等[2]从人体中克隆到Y染色体上1个名称为SRY的基因。此后，SRY基因在其他动物中相继被克隆出来，并证实其长度约为35 kb，编码79个氨基酸(HMG盒)，这是SRY基因主要的功能区。研究发现，人与哺乳动物的HMG区域的同源性高达70%，而在其他区域如此高的同源性[3-8]。Y染色体上SRY基因的发现是哺乳动物性别决定理论的重大突破，也为性别控制技术奠定了理论基础。

1.2性别控制的方法目前，性别控制的方法主要分为受精前的控制(X精子与Y精子的分离)；与受精后的控制(早期胚胎的性别鉴定)。受精前的控制是指通过在体外对精子进行干预，使在受精之前便决定后代的性别；受精后的控制指通过对胚胎进行性别鉴定，从而获得所需性别的后代。在家畜生产实践中，较为理想的方法是先分离X、Y精子，然后再根据需求进行人工授精，从而得到所需性别的后代。

1.2.1X与Y精子分离的方法。从20世纪50年代开始，人们就开始了对X与Y精子的大小、带电荷数、密度及活力等方面的研究。研究表明，X、Y精子的差异主要表现在X精子的DNA含量大于Y精子以及Y染色体上的性别决定序列SRY[2，9]。此外，二者在其他方面无明显差异。X与Y精子DNA含量的差异就是X、Y精子分离的理论基础[10]。

X与Y精子的分离方法有很多种，包括物理分离法，沉积分离法、梯度离心法、电泳法、白蛋白沉淀法、免疫学分离法以及流式细胞仪分离法等。其中，流式细胞仪分离法具有效率高、准确率高等优点，是目前畜牧生产中较为高效、可靠且使用范围广泛的一种方法[11-12]。

1.2.1.1流式细胞仪分离法。目前，在生产中使用最多、技术最为成熟的就是流式细胞仪分离法。此方法的理论依据就是X、Y精子头部DNA含量的差异。在家畜中X精子的DNA含量比Y精子高3%～4%[10]。根据这一差异，用DNA特异性染料(常用Hochest33342)对精子进行染色，染料着色量与DNA含量成正比[13]。经过染色的精子会连同少量的稀释液逐个通过激光束，然后精子上的荧光染料就会被激发形成光学信号，探测器根据发光强度的强弱将信息传递给计算机，计算机的信息处理系统会使发光强度高的带正电，弱的带负电，然后带电液滴通过高压电场被分开，进入2个不同的收集管，正电荷收集管为X精子，负电荷收集管为Y精子[1，12]。经过多年的改进，流式细胞仪分离的准确率可达90%以上，此方法已经用于商业化，特别是在奶牛的生产中较为常用。

1.2.1.2免疫学分离法。免疫学分离法是根据利用H-Y抗体检测Y精子质膜上存在的H-Y抗原，以此来分离X精子和Y精子[14]。Zavos[15]和Jones等[16]利用此方法都成功分离出Y精子。但是，Hendriksen P J M[17]研究表明X和Y精子会共享抗原，它们都能够结合抗H-Y抗原抗体。此外，免疫学分离法处理精子的时间较长，会降低精子活力，从而导致受胎率的降低，因此此方法在生产实践中难以推广[18]。

1.2.1.3其他常见的分离方法。

(1)密度梯度离心技术在20世纪70年代就已经出现。此方法的原理是X、Y精子的密度和比重不同，但由于其差异并不大，X、Y精子的比重会随精子成熟情况的不同而变化，因此该方法的分离效果并不是十分理想，在生产实践中也并不常用[19-20]。

(2)电泳法的原理是X、Y精子表面携带的电荷不同，因此在电泳时会分别向两极移动并形成2条泳带，从而使精子分离[21]。但是，此方法的分离结果的准确性和重复性都不理想，且精子在电泳液中不易存活，因此此方法在生产中也不常用[22]。

(3)白蛋白柱分离法的技术基础是Y精子在白蛋白溶液中的泳动速度比X精子快。很多科研人员用此方法分离人或动物的X、Y精子，但结果却差别很大[23-24]。Ericsson等[25]首次用此方法分离到85%的人类精子。Evans等[26]认为白蛋白柱法不能有效分离人类的X、Y精子。由于此方法的效果存在较大的争议，所以此方法也不太常用。

1.2.2早期胚胎的性别鉴定。通过对早期胚胎进行性别鉴定，移植已知性别的胚胎，也可以控制后代的性别比例。对胚胎进行性别鉴定有许多方法，如核型分析法、SRY-PCR法、免疫学法和X-相关酶法等。目前，在生产实践中最有效、最常用的早期胚胎的性别鉴定方法就是SRY-PCR法。

1.2.2.1核型分析法。不同物种的染色体都有各自特定的形态结构，包括染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体大小等特征，且这些形态特征是相对稳定的。胚胎的性别鉴定就是分析胚胎细胞的染色体组，具有XX染色体的是雌性胚胎，具有XY染色体的是雄性胚胎。核型分析一般采用切割胚(晚期桑葚胚、囊胚或扩张囊胚)，检测时一半用于鉴定性别，另一半用于移植或冷冻[27]。如果想要扩张囊胚，切割时可切成含内细胞团的半胚和含滋养层细胞的半胚，前者用于冷冻和移植，后者用于核型分析[27]。

核型分析法的主要步骤如下：先取部分胚胎细胞，用秋水仙素处理使细胞处于有丝分裂的中期，然后制成染色体标本，通过显微摄影分析染色体组成并确定胚胎性别[1]。此方法的准确率可达100%，但此方法对胚胎损伤较大，且操作有一定难度，因此在生产实践中难以推广。

1.2.2.2X-相关酶法。X-相关酶法是通过测定早期胚胎中与X染色体连锁相关酶的活性来鉴定胚胎性别的一种方法。此方法通过观察相关酶与底物着色反应的颜色来鉴别胚胎性别。此方法的准确性较低，且不能检测桑椹胚以后的胚胎性别，因此在生产中并不常用[28]。

1.2.2.3免疫学法。胚胎的免疫学法与X、Y精子分离的免疫学法很相似，都是根据雄性的H-Y抗原去鉴别性别，就是利用H-Y单克隆抗体或血清检测胚胎是否存在H-Y抗原，从而达到对胚胎进行性别鉴定的一种方法。利用此方法鉴定小鼠和奶牛的胚胎性别，其雄性与雌性鉴别的准确率均能达到80%以上[29-30]。由于此方法在操作中会破坏胚胎，且H-Y抗原是弱抗原，观察人员的主观因素对结果的影响很大，从而会导致结果存在较大误差，因此在生产实践中也难以推广。

1.2.2.4SRY-PCR法。SRY-PCR法就是指利用雄性特异性DNA探针和PCR扩增技术对哺乳动物早期胚胎进行性别鉴定的一种方法。首先提取胚胎的DNA，以此为模板，用SRY基因的一段碱基作为引物进行PCR扩增，再用SRY特异性探针对扩增引物进行检测，若检测结果为阳性即为雄性胚胎；若检测结果为阴性，则为雌性胚胎。此外，也可对PCR产物进行电泳检测，出现特异性条带的为雄性，不出现特异性条带的为雌性[28]。此方法对胚胎损伤小，准确率高，可达95%以上[31]。此方法在生产中较为常用，运用此方法时应注意避免污染，防止出现假阳性[32]。

2　性别控制在家畜生产中的应用

性别控制技术对于家畜生产具有重大意义，在生产中能够增加所需性别的动物，提高家畜生产的经济效益，特别是对奶牛产业起着重要的推动作用。此技术还可以通过控制后代的性别，从而避免异性胚胎移植导致的孪生不育现象；同时对预防伴性遗传疾病也起着举足轻重的作用[28]。

2.1流式细胞仪在家畜生产中的应用由于对胚胎进行性别检测时，会对胚胎造成一定程度的损害，从而会导致妊娠率的降低；鉴定时对样本有一定的要求，对劣质胚胎的鉴定效果较差，因此在家畜生产上使用最多的是流式细胞仪分离法[12]。

在奶牛行业中，流式细胞仪得到了广泛应用。截至2012年，全国拥有36台流式细胞仪，分布在洛阳白马寺种公牛站、河南鼎元种牛有限公司、北京奶牛中心种公牛站、赛克星股份有限公司以及其他一些生物公司和种公牛站[33]。

2006年宝鸡市在陕西省率先使用了性控冻精技术，累计已配种上万头，母犊率达92%以上[34]。“十一五”期间，在全国2 700多个奶牛场累计使用奶牛性控冻精150多万支，生产奶牛母犊50余万头，总产值达25亿元[35]。陕西省千阳县2008年开始使用此技术，截至2015年底累计产犊母犊单项增加经济收入836.42万元[36]。

2.2SRY-PCR技术在家畜生产中的应用对于性染色体差异较小的物种而言，使用X、Y精子分离法较为困难，且后代有一定的畸形率[37]。因此，SRY-PCR在家畜生产中也是一种常见的方法。PCR具有快速、简便、特异性强等特点，此方法在养牛业中已经广泛应用[38]。在试验中，PCR分为常规PCR、多重PCR和巢式PCR。早期试验大多采用常规PCR法，后来为避免扩增失败而导致的判断结果的错误，一般采用多重PCR法，在扩增性别特异引物的同时扩增常染色体序列作为阳性对照[39]。巢式PCR法就是同时根据1个性别特异基因设计1对外引物，获得被测基因较长的扩增产物，再根据扩增产物序列设计第2对引物(内引物)对产物进行第2次扩增[37]。研究表明，与其他PCR法相比，巢式PCR法胚胎性别鉴定的灵敏度得到大大提升[40-41]。在实际生产中，将多重PCR与巢式PCR结合起来可以提高结果的可靠性[37]。在奶牛产业中，为了多生母犊，可以对SRY基因进行定点突变，使之不再表达，从而控制牛犊性别[42]。

3　小结

性别控制的各种技术都有各自的优点与缺点。随着科学技术的进步，性别控制技术的准确度与灵敏度一定会得到更大提升。相信在不久的将来，性别控制技术就会走上商业化与生产化的规模，同时也一定会为家畜产业带来更大的经济效益。

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Sex Control Technology and Its Application in Livestock Production

GUO Hai-yan,ZHANG Hao,LI Yong-jun*et al

(College of Animal Science and Technology,Yangzhou University,Key Laboratory for Animal Genetic,Breeding,Reproduction and Molecular Design of Jiangsu Province,Yangzhou,Jiangsu 225009)

Fertility is an important economic indicator in animal production.Breeding new technology plays a huge role in promoting the production and breeding of livestock.And sex control technology is an important milestone in the history of the development of new technology of reproduction.Based on these,we reviewed the sex control technology and its application in livestock production.

Fertility;Sex control;Livestock production

郭海燕(1992- )，女，河南洛阳人，硕士研究生，研究方向：动物遗传育种与繁殖。*通讯作者，教授，博士，硕士生导师，从事动物繁殖学和羊生产学的教学和科研工作。

2016-07-13

S 814

A

0517-6611(2016)25-116-03