万玉林， 葛玉凤， 武发菊， 安芳兰， 刘学荣， 杨进才， 张云德　(中农威特生物科技股份有限公司，甘肃兰州 730046)



兽用疫苗生产中支原体污染检测和预防

万玉林， 葛玉凤， 武发菊， 安芳兰， 刘学荣*， 杨进才， 张云德(中农威特生物科技股份有限公司，甘肃兰州 730046)

摘要细胞培养中支原体污染严重影响兽用生物制品的质量和安全性，会造成巨大的经济损失。对兽用疫苗生产中支原体污染检测方法、相关衍生技术及其预防控制等方面进行了综述，旨在为兽用生物制品生产过程中支原体污染的检测工作提供参考。

关键词支原体；疫苗生产；污染；检测；预防

1898年，Nocard和Reux首次从患传染性胸膜肺炎病牛中分离出支原体。随着诊断技术的提高，人们对支原体的认识不断深入，目前在自然界中该类微生物近100余种，可直接或间接引起人类及动植物各种疾病。国内外均有研究表明，支原体感染可引发人和动物呼吸道感染、生长发育停滞及免疫系统损伤，同时对以培养细胞为材料的生物制品生产亦是棘手问题，因而引起了医学界和兽医工作者的广泛关注。笔者对兽用生物制品生产中3种支原体检测方法(传统检测法、血清学检测法及分子生物学法)及相关衍生技术进行了比较，并结合了预防支原体污染的有效措施，以期为兽用疫苗生产中细胞培养物的支原体污染提供准确简便的检测手段。

1支原体的特性及检测重要性

支原体(Mycoplasma)隶属柔膜体纲，是一类缺乏细胞壁的原核微生物，其个体微小，介于细菌和病毒之间，呈高度多态性，可通过常用的滤菌器，其毒株主要通过特殊的结构黏附于宿主细胞膜上，并与相应的受体结合，引起宿主细胞膜结构的改变及诱导宿主细胞产生某些细胞因子，如白细胞介素、干扰素等，从而促使宿主细胞免疫反应异常诱发各种疾病。在兽用疫苗生产中，由支原体引起的细胞污染发生率可达30%～60%，支原体污染可引起细胞生长抑制、DNA片段化及碳水化合物、核酸和蛋白质的合成受阻[1]，进而影响兽用生物制品的质量和安全性。宁宜宝等[2]采用培养分离法对78批普通鸡胚制活毒疫苗和31批鸡胚成纤维细胞制疫苗进行了支原体检测，结果表明国内普通疫苗和细胞生产活毒疫苗支原体污染严重，不仅造成了生物制药企业巨大的经济损失，而且对疾病防疫工作带来困难。WHO和新兽药典规定所有细胞生产的活疫苗都不能检测到支原体污染，因此在生物制品生产过程中支原体的检测工作极为重要。

2支原体的检测

2.1传统检测方法

2.1.1直接培养法。在《中华人民共和国兽药典》2010年版附录[3]中有规定，支原体直接培养法为支原体检测的标准方法。通过将样品接种到支原体培养基上，观察液体培养基的颜色变化和固体培养基上是否有支原体菌落来判断试验结果，准确率高，但培养时间较长，一般在28 d左右，并且在同一培养基中不能完全检测出所有的支原体类型，常用于对种毒和成品的检测。

2.1.2DNA荧光染色法。DNA荧光染色法，又称指示细胞法，是将待测样品接种于指示细胞中培养，以特异性荧光染料染色，通过在荧光显微镜下观察附着在细胞表面的支原体DNA着色来判断有无支原体污染。此检测方法耗时短，可同时检测多个样品，且能检测出培养法无法检测的支原体，若在配苗前进行初检，去除不合格样品，可以有效减少生产损失，保证疫苗质量。唐书谦等[4]分别采用DNA荧光染色法和直接培养法对细胞培养中常用细胞系及培养基进行了支原体检测，结果表明DNA荧光染色法较直接培养法敏感性高，简单、方便，需时较少，结果稳定可靠。

1987年，美国食品和药品管理局(FDA)提出对全部细胞系和用细胞生产的活疫苗必须检查支原体，推荐采用DNA荧光染色法[5]。但是，因细胞核酸碎片易黏附至细胞膜上或样品原因极易引起误判，因此需要更简单有效的检测方法。2.2血清学法

2.2.1被动颗粒凝集试验(PPA) 。将可溶性抗原或抗体吸附于与免疫无关的、一定大小的颗粒状载体表面，并与相应的抗体或抗原作用，在有电解质存在的适宜条件下即可发生凝集，称为被动颗粒凝集反应。此方法可应用于细菌、支原体的鉴定和抗体的定性检测。吴晓等[6]分别用被动颗粒凝集试验、ELISA法、金标渗滤法及冷凝集试验进行了肺炎支原体的检测，通过比较不同滴度抗体的灵敏性和特异性，结果表明被动凝集法操作简单，精确性和敏感度更高，更适宜于临床应用。

2.2.2酶联免疫吸附试验(ELISA)。1971年，Engvall 等[7]建立了一种生物活性物质微量测定新技术，即ELISA 检测法，是目前诊断人和动物肺炎支原体的较实用和可靠的方法之一，主要包括间接法、双抗体夹心法和抗原竞争法。因其检测方法简单，具有良好的特异性和敏感性，一次可以完成大量样品的检测，已广泛应用于临床医用作为肺炎支原体检测的常规方法。崔玉明等[8]用不与Mg发生交叉反应的Mp单克隆抗体建立双抗体夹心ELISA法检测上呼吸道分泌物中肺炎支原体抗原的方法，为临床诊断Mp感染提供了一种有效的方法。

2.3分子生物学技术

2.3.1PCR检测技术。由于支原体生长缓慢、营养要求高、种间存在交叉抗原等生物学特性，支原体的传统检测法和血清学法具有一定的局限性[9]。随着对支原体的核酸结构、分子组成及其特异性的了解，20世纪90年代初国际上已将PCR技术应用于支原体检测中，其主要通过病毒模板RNA/DNA抽提、PCR扩增、电泳等技术观察目的条带的存在与否，判断样品有无支原体污染。贾丽艳等[10]运用支原体的16S rRNA基因序列设计特异性引物，以兽用生物制品中常见的支原体DNA为模板进行PCR扩增，优化反应体系，建立了兽用疫苗支原体污染的PCR检测方法。该方法与传统的直接培养法相比具有更高的特异性和灵敏性，已广泛应用于兽用生物制品的生产中，但其对试验环境和仪器要求高，易交叉污染[11]。

2.3.2巢式PCR 检测法。在PCR方法的基础上进一步优化，通过设计巢式 PCR 引物，根据扩增后目的片段的有无判断污染情况，并根据片段大小判断支原体污染类型，进而推断污染源。由于类支原体16S～23S rDNA的种属差异性，李菁竹[12]利用ISR序列对细胞污染中常见的5种支原体进行巢式PCR扩增，通过考察检测限、特异性及耐受性等参数发现此方法可以同时有效检测多种支原体引起的污染，具有高灵敏性、高度特异性、简单快速、避免交叉污染等特点，使多个取样点的在线检测成为可能，可有效应用于生产过程的控制，防止污染的蔓延，确保疫苗生产质量。

2.3.3实时荧光定量PCR技术。1996年，美国Applied Biosystems公司首次推出实时荧光定量PCR法[13]，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析。宋建领等[14]建立了猪肺炎支原体的实时荧光定量PCR检测方法，特异性、敏感性及重复性试验表明仅猪肺炎支原体检测结果均为阳性，可检测到101copies/μL DNA 模板，每份样品的变异系数均小于5%，表明该方法精确、灵敏、重复性高。目前，该方法已被应用于动物营养与繁殖、动物遗传育种及动物疾病检测和预防等领域，但由于无统一标准品、不能监测扩增产物的大小、荧光素种类和检测光源的局限性及检测成本高等因素的制约，因而限制了其广泛应用。

2.3.4DNA分子杂交检查法。在原核生物中，rRNA是高度保守的。提取已知支原体的rRNA，克隆至质粒PBR325中进行扩增，以缺刻转移法制成P32标记的探针。将待检查的细胞消化悬浮后，低速离心，取其上清液，提取DNA后用EcoR I降解2 h，凝胶电泳，采用Southern blot法转移到硝酸纤维素膜上，以探针在膜上与之杂交。此膜X光底片重迭放置24～48 h即可根据探针存在的部位判定结果。此检测方法特异性高，支原体探针与大多数原核细胞DNA可杂交，不会与真核细胞DNA杂交，可完成支原体种类的大致鉴别。

3预防与控制

自然界存在的支原体有120多种，但在生物制品的生产过程中有95%以上的支原体污染来自猪源的猪鼻支原体、牛源的精氨酸支原体和莱氏支原体、人源的口腔支原体和发酵支原体。在感染的组织细胞中，支原体的密度可高达107克隆单位/mL，可引起细胞形态和遗传物质的改变，干扰病毒复制，也可引起宿主细胞免疫能力的改变，诱导干扰素的产生。因此，在以培养细胞为材料的兽用疫苗生产中，支原体的防治工作尤为重要。国内外均有文献报道可使用抗生素(如卡那霉素)阻断支原体核糖核蛋白体循环过程[15]，但可能影响细胞的正常生理功能，甚至可能对细胞造成毒害作用，在使用中应控制其剂量(50～100 U/mL)。在纠正支原体污染过程中，保持细胞营养液为酸性环境(pH 6.6～6.8)，可以有效抑制支原体生长。也有学者提出将有效的抗生素配合克隆，如使用泰霉素和麦诺霉素处理支原体污染的细胞后，可以有效缓解支原体污染状况，且操作简单，毒副作用较小，但不能完全去除。目前，在兽用生物制品生产中，支原体种类的鉴定及检测主要是为了检测细胞的污染源，从而切断污染源，以期进行有效预防与控制。较常用的支原体检测方法是直接培养法，但仅依靠此方法还远远不能满足实际快速、准确检测的需要，应将ELISA法、常规PCR、实时荧光定量PCR、DNA分子杂交检查法等方法与分离培养法结合使用，以适应不同来源样本的特殊检测要求。4展望

支原体污染的诊断是兽用疫苗生产中保证产品质量的关键技术。今后，相关研究的发展方向有：①通过建立准确、快速、简便的检测方法，有效减少下游产品的污染；②研制特异性及敏感性高的支原体检测试剂盒，快速准确检测疫苗生产中细胞培养物支原体污染，对兽用疫苗生产企业生产成本控制有重要意义。

在防治方面，建立有效预防的支原体疫苗是今后支原体检测工作的研究重点。虽然对家畜支原体疫苗的研发已取得了一定进展，但由于受佐剂、免疫途径及载体等因素的影响，免疫效果均较差，目前还未商品化，尚需进一步探索。

参考文献

[1] NIKFARJAM L，FARZANEH P.Prevention and detection of mycoplasma contamination in cell culture[J].Cell journal,2012，13(4)：203-212.

[2] 宁宜宝.国内禽用活病毒疫苗中支原体污染的调查报告[J].中国兽药杂志，1993，21(1)：34-36.

[3] 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典:2010年版[S].北京：中国农业出版社，2011.

[4] 唐书谦，伍津津,杨涛，等.细胞培养中污染支原体的检查[J].第三军医大学学报，2009，31(23)：2403-2404.

[5] 黄海波.细胞培养感染支原体的检测和清除研究进展[J].中国兽药杂志，1997,27(3)：57-60.

[6] 吴晓，郑颖,赵志钢，等，被动凝集法检测肺炎支原体抗体的实验室研究[J].中国卫生检验杂志，2009，19(12)：2886-2888.

[7] ENGAVALL E，PERLMANN P.Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) quantitative assay of immunoglobulin G[J].Immunochemistry,1971,8：871-874.

[8] 崔玉明，蔡平生，郭善原，等.双抗体夹心ELISA法检测肺炎支原体抗原方法的研究[J].中国人兽共患病杂志，2002，18(4)：120-121.

[9] 姚晓辉，练炳洲，王林川，等.支原体检测方法的建立及在疫苗检验中的应用[J].中国动物保健，2010：23-26.

[10] 贾丽艳，李彦明，张映.兽用疫苗支原体污染的PCR检测技术的建立及应用[J].动物医学进展，2005，26(6)：55-58.

[11] 魏欣球.三种血清学方法检测肺炎支原体抗体的比较[J].医学理论与实践，2010，23(3)：328-329.

[12] 李菁竹.支原体污染的巢式PCR检测法的摸索及其初步验证[D].武汉：武汉生物制品所，2010:1-59.

[13] 周晓丽，朱国坡,李雪华，等.实时荧光定量 PCR 技术原理与应用[J].中国畜牧兽医，2010,37(2)：87-89.

[14] 宋建领，高华峰，信爱国，等.猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用[J].畜牧与兽医，2013,45(5)：71-74.

[15] 何大澄，张鸿卿,薛绍白.支原体污染防治研究的新进展[J].细胞生物学杂志，1986，8(1)：23-26.

Detection and Prevention of Mycoplasma in the Production of Veterinary Vaccines

WAN Yu-lin, GE Yu-feng, WU Fa-ju, LIU Xue-rong*et al

(China Agriculture Vet. Bio. Science and Technology Co. Ltd., Lanzhou, Gansu 730046)

Key wordsMycoplasma; Vaccine production; Pollution; Detection; Prevention

AbstractMycoplasma contamination in cell culture affects the quality and safety of veterinary biological products, and can cause huge economic losses. In this research, we reviewed the veterinary mycoplasma contamination detection method, related derivative technology and prevention used in vaccine production, aiming at providing the references for mycoplasma contamination detection during the production of a veterinary biological production.

基金项目兰州市科技计划项目(2014-1-143)。

作者简介万玉林(1976- )，男，甘肃陇南人，助理研究员，硕士，从事口蹄疫疫苗生产与细胞培养工艺研发。*通讯作者，副研究员，硕士，从事国家重大动物疫病预防用生物制品技术研发。

收稿日期2016-01-29

中图分类号S 859.79

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)07-081-02