杨李娇,郭 鹏,许涵杰,郭 鹏　(大连民族大学，辽宁大连 116600)



欧美杨PdSIKI基因的克隆与功能分析

杨李娇,郭 鹏,许涵杰,郭 鹏*(大连民族大学，辽宁大连 116600)

摘要[目的]筛选抗旱节水欧美杨品种。[方法]以欧美杨为材料，通过RT-PCR方法从欧美杨叶片中克隆到抗旱PdSIKI基因，将其转入拟南芥中，研究转PdSIKI基因拟南芥的表型性状和生理指标。[结果]PdSIKI基因开放阅读框为2 442 bp，编码813个氨基酸。蛋白质分析表明PdSIKI蛋白含有典型的类受体蛋白激酶高度保守的丝氨酸/苏氨酸结构域和跨膜区域。荧光定量PCR分析表明该基因在顶端叶中表达量最高，功能叶、根和茎中则无表达。逆境胁迫分析表明该基因受NaCl、ABA和干旱诱导表达明显。与野生型相比，干旱处理下转PdSIKI基因拟南芥表现出更强的生长状态，且叶绿素含量降低，丙二醛含量升高。[结论]超表达PdSIKI基因提高了拟南芥抗干旱能力。

关键词欧美杨；PdSIKI基因；克隆； 表达；干旱

欧美杨107(Populusdeltoides×Populusnigra)是我国1984年从引自意大利的“美洲黑杨×欧洲黑杨”无性系中选育而成，适合我国淮河、黄河流域及辽河流域以南地区种植，也适合西北地区种植。其材性良好，杆型优美，树冠窄，侧枝细，叶满冠，抗病虫，抗风折。近年来我国引进了许多优良欧美杨无性系用于营造大面积的速生丰产林并取得很好的经济和社会效益，但高耗水量的缺点限制了其进一步推广。除采取工程手段外通过分子生物学手段改良欧美杨的综合抗逆性、培育抗逆新品种，已成为我国乃至世界农林业持续高效发展的重大课题之一[1]。

蛋白激酶是一类催化蛋白质磷酸化反应的酶，它能把腺苷三磷酸(通常是ATP)上的γ-磷酸转移到蛋白质分子的氨基酸残基上。植物类受体蛋白激酶在植物体内起着重要的信号转导作用,几乎参与所有的细胞代谢过程,包括植物细胞抗逆反应[2]、植物形态发生[3]、自交不亲和[4]等生理生化反应。目前已从多种高等植物中分离出一系列受体蛋白基因,并分析了其基因特征和表达特性[5-8]。OsSIK1是从水稻中克隆到的一种类受体蛋白激酶基因，超表达该基因明显提高了水稻的抗旱和抗盐能力[9]。该基因具有典型的类受体蛋白激酶和跨膜区域的特点，且受多种逆境胁迫诱导。笔者通过RT-PCR方法从欧美杨叶片中克隆到同源SIK1基因——PdSIKI，将该基因转入拟南芥，研究转基因拟南芥的抗旱能力，旨在为探究PdSIKI基因在欧美杨抗旱过程中信号转导的角色，以及为欧美杨定向遗传改良和品种创新提供理论依据和基因资源。

1材料与方法

1.1材料供试材料为欧美107速生杨(Populus×euramericanacv．‘74/76’)。将欧美杨扦插苗种植在20 L花盆中，在温室中自然生长60 d，期间每3 d充分浇水并外施草炭土以保证其快速生长。

1.2PdSIKI基因的克隆通过毛果杨基因组网站http:∥genome． jgi-psf． org /Poptr1_1/Poptr1_1.home.html搜索到OsSIK1同源基因010G157400.1(别名：Pt-SIK1.1)。以总 RNA 为模板，使用 M-MLV Reverse Transcriptase 进行反转录，合成 cDNA 第 1 链，作为模板用于扩增PdSIKI基因。反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，56 ℃退火50 s，72 ℃延伸60 s，34循环；72 ℃再延伸10 min；4 ℃终止。PdSIKI上游引物：ATGTCGGGTCTGGATCAACCATCCC，PdSIKI下游引物：CTAATCACAAAGATTTTGAATGGTTTGT。

1.3PdSIKI基因的表达分析选取3株长势类似的欧美杨分别进行以下处理：①盐处理。用2 L 300 mmol/L NaCl溶液进行浇灌，并分别在0、2、4、6 h摘取顶端叶片置于液氮中，然后在-80 ℃超低温冰箱中保存备用。②干旱处理。将欧美杨放于室外自然干旱，并分别在0、2、4、6 h摘取顶端叶片置于液氮中，然后在-80 ℃超低温冰箱中保存备用。③ABA处理。用250 mmol/L ABA溶液进行处理0、2、4、6 h，在-80 ℃超低温冰箱中保存备用。组织特异表达分析：提取未胁迫处理的植株顶端叶、功能叶、茎和根置于液氮中，然后在-80 ℃超低温冰箱中保存备用。分别提取其总RNA 反转录成cDNA 用于荧光定量PCR 分析。特异引物ER5: 5′-AGGAACCTTTGGAAGAGTATCAAAT-3′，ER3: 5′-TGGATATCATGAACAAAACCCTCAT-3′。每种处理重复3～5次。

1.4转PdSIKI基因拟南芥的功能分析利用农杆菌介导的方法进行拟南芥的遗传转化，将所收获的T1代种子消毒后平铺于含50 μg/mL潮霉素的MS选择培养基中；14 d后挑选转化体转入MS培养基中，7 d后转入土壤中生长；收获T2代种子，利用PCR鉴定阳性植株并进行观察和生理鉴定。参照赵世杰等[10]的方法测定干旱处理下野生型和转基因拟南芥的叶绿素和丙二醛(MDA)含量，重复3～5次。

2结果与分析

2.1PdSIKI基因的克隆利用毛果杨基因组数据库(http://genome.jgi-psf.org/Poptr1_1/Poptr1_1.home.html)以欧美杨叶片的cDNA 为模板，设计特异引物进行PCR 扩增。通过RT-PCR反应，获得欧美杨同源SIK1基因，命名为PdSIKI。该基因编码阅读框为2 442 bp，编码813个氨基酸。与毛果杨SIK1基因核苷酸和氨基酸的同源性分别为95.75%和93.07%(图1)。

2.2PdSIKI 蛋白质预测和跨膜分析通过SMART软件预

测PdSIKI蛋白结构具有典型的类受体蛋白激酶的特点。利用TMpred软件分析表明， PdSIKI的大部分氨基酸残基都在零点以下，具有高度亲水性，少部分在零点以上，具有疏水性。另外，PdSIKI有一个明显的跨膜结构(图2)。

2.3PdSIKI基因的表达分析由图3可知，PdSIKI基因在顶端叶中表达量最高，而在功能叶、茎、根无表达。为了进一步了解PdSIKI基因在不同胁迫条件下的表达,利用荧光定量PCR对欧美杨PdSIKI基因的表达进行了分析。由图4可知，在干旱胁迫处理下,PdSIKI基因被诱导表达明显,处理2 h 时表达量达到最大,约为对照的5倍;在盐处理下,PdSIKI基因被诱导表达明显，处理4 h时表达量达到最大，约为对照的6倍；在ABA处理下，PdSIKI基因被诱导表达明显,处理4 h 时表达量达到最大,约为对照的7倍。

2.4转基因拟南芥的表型性状将生长7 d的转基因拟南芥和野生型幼苗置于干旱处理下，结果显示，与野生型相比，转基因拟南芥在干旱处理10和20 d下表现出更强的生长状态(图5)。

2.5转基因拟南芥的生理指标由图6可知，干旱处理(土壤饱和含水量的20%)后，野生型和转基因株系的叶绿体含量均降低，但转基因株系的叶绿素含量相对野生型降低较少。其中野生型叶绿素含量降低了72%，T2-2降低了60%，T2-6降低了49%，T2-10降低了56%。

在未胁迫处理的植株中，转基因植株的MDA含量与野生型相比无显著差别，而干旱胁迫处理后，MDA含量均升高。野生型中MDA含量高于转基因株系，其中野生型MDA含量是T2-6株系的1.6倍，这说明在干旱胁迫处理下转基因植株膜脂过氧化程度较轻。

3结论与讨论

干旱等非生物胁迫严重限制了欧美杨的进一步推广和应用，随着分子生物学的发展，研究抗逆相关基因的分子表达调控机制已成为当前杨树抗逆品种培育的重要手段[9-11]。类受体蛋白激酶作为胁迫表达相关基因的一部分参与植物体应答逆境与防御相关的过程,受到极大的关注。该研究从欧美107速生杨叶片中克隆到SIKI同源基因—PdSIKI。该基因编码阅读框为2 442 bp，编码813个氨基酸。通过SMART软件预测PdSIKI蛋白结构具有典型的类受体蛋白激酶的特点。利用TMpred软件分析表明， PdSIKI的大部分氨基酸残基都在零点以上，具有高度亲水性，少部分在零点以下，具有疏水性。另外，PdSIKI有一个明显的跨膜结构。

PdSIKI基因的组织特异性表达特征表明该基因在顶端叶中表达量最高，而在功能叶、茎、根无表达。该结果暗示PdSIKI基因与其他蛋白激酶一样参与植物的生长发育。为了进一步了解PdSIKI基因在干旱胁迫下的分子机制，利用荧光定量PCR对欧美杨PdSIKI基因的表达进行了分析。结果表明，PdSIKI在干旱、高盐、ABA等逆境胁迫下表达量均升高。其中，在ABA处理下PdSIKI基因快速积累并在4 h达到峰值，说明该基因参与了ABA途径的信号转导模式。在盐胁迫处理下，PdSIKI基因被诱导表达明显，处理4 h时表达量达到最大，约为对照的6倍；在干旱处理下，PdSIKI基因被诱导表达明显，在处理2 h时达到最大，约为对照的5倍，这暗示其参与渗透调节作用。大量研究表明受体蛋白激酶复合物之间相互作用从而传递信号,受体蛋白激酶聚合成二聚体或寡聚体是其激活的必要条件,以单体形式存在的类受体蛋白激酶不具有活性。如植物激素油菜素类固醇(brassinosteroid,BR) 的信号转导需要BRI1 和BAK1 之间相互作用组成受体复合物才能完成[12-15]。因此，PdSIKI基因参与逆境胁迫信号转导的网络可能采取类似的模式。但蛋白激酶之间的相互作用以及在各自所处的信号转导系统中的地位尚不明确，需要进一步研究。

为了进一步验证PdSIKI的抗旱性，对干旱胁迫下转基因和野生型拟南芥的叶绿体含量进行比较，结果发现转基因的3个株系都具有较高的叶绿素含量，表明PdSIKI明显减弱了干旱胁迫对植物光合机构的损害。MDA含量升高说明PdSIKI明显提高了拟南芥的抗细胞过氧化能力。

该研究通过欧美杨PdSIKI基因的克隆与功能研究，为进一步了解受体蛋白激酶在植物逆境胁迫分子反应机制以及下一步的转基因杨树研究奠定理论基础。

参考文献

[1] CHEN T T,YANG Q C,GRUBER M,et al.Expression of an alfalfa (MedicagosativaL.) enthylene response factor geneMsERF8 in tobacco plants enhances resistance to salinity[J].Mol Bio Report,2012,39:6067-6075.

[2] GAO R H,DUAN K,GUO G M,et al.Comparative transcriptional profiling of two contrasting barley genotypes under salinity stress during the seedling stage[J].Inter J Genom,2013,2013:972852.

[4] HACKENBERG D,KEETMAN U,GRIMM B.Homologous NF-YC2 subunit fromArabidopsisand tobacco is activated by photooxidative stress and induces flowering[J].Int J Mol Sci,2012,13:3458-3477.

[5] KANAWAPEE N,SANITCHON J,LONTOM W,et al.Evaluation of salt tolerance at the seedling stage in rice genotypes by growth performance,ion accumulation,proline and chlorophyll contentp[J].Plant soil,2012,358:235-249.

[6] KNIGHT H,ZARKA D G,OKAMOTO H,et al.Abscisic acid induces CBF gene transcrip and subsequent induction of cold-regulated genes via the CRT promoter element[J].Plant Physiol,2004,135:1710-1717.

[7] LI R L,SHI K F C,FUKUDA,et al.Effects of salt and alkali stresses on germination,growth,photosynthesis and ion accumulation in alfalfa (MedicagosativaL.)[J].Soil Sci Plant Nutr,2010,56: 725-733.

[8] LI W F,WANG D L,JIN T C,et al.The vacuolar Na+/H+Antiporter GeneSsNHX1 from the halophyteSalsolasodaconfers salt tolerance in transgenic alfalfa (MedicagosativaL.)[J].Plant Mol Biol Rep,2011,29:278-290.

[9] LONG R,WANG Q,KANG J,et al.Molecular cloning and characterization of a novel stress responsive gene in alfalfa[J].Biol Plant,2012,56:43-49.

[10] 赵世杰，刘华山，董建纯，等.植物生理学实验指导[M].北京：中国农业科技出版社，2002.

[11] LU Y J,LI N Y,SUN J,et al.Exogenous hydrogen peroxide,nitric oxide and calcium mediate root ion fluxes in two non-secretor mangrove species subjected to NaCl stress[J].Tree Physiol,2013,33: 81-95.

[12] MAKSIMOVIC J D,ZHANG J Y,ZENG F R,et al.Linking oxidative and salinity stress tolerance in barley: Can root antioxidant enzyme activity be used as a measure of stress tolerance?[J].Plant soil,2013,365: 141-155.

[13] MA X J,SUN M,SA G,et al.Ion fluxes inPaxillusinvolutus-inoculated roots ofPopulus×canescensunder saline stress[J].Environ Exp Bot,2014，108: 99-108.

[14] RIERA M,PERACCHIA G,DE NADAL E,et al.Maize protein kinase CK2: Regulation and functionality of three β regulatory subunits[J].Plant J,2001,25: 365-374.

[15] MASRALLAH M E,NASRALLAH J B.Molecular cloning of a putative rector protein kinase encoded at the Self-incompatibility locus ofBrassicaoleracea[J].Prot Natl Acad Sci USA,1991,88: 8816-8820.

[16] SONG W Y,WANG G L,CHEN L L,et al.A peceptor kinase like protein encoded by the rice disease resistance gene,Xa21 [J].Science,1995,270: 1804-1806.

[17] STEIN J C,HOWLETT B,BOYES D C,et al.Molecular cloning of a putative receptor protein kinase gene encoded at the selfincompatibility locus ofBrassicaoleracea[J].Prot Natl Acad Sci USA,1991,88: 8816-8820.

[18] ZHOU X M,ZHANG L S,YANG Y.Analysis of wheat dehydrin like gene during water stress condition by sem-iquantitative RT-PCR[J].Acta Bot Boreal,2007,27(11):2158-2162.

Cloning and Functional Analysis ofPdSIKIfromPopulusdeltoides×Populusnigra

YANG Li-jiao,GUO Peng,XU Han-jie,GUO Peng*

(Dalian Nationalities University,Dalian, Liaoning 116600)

Key wordsPopulusdeltoides×Populusnigra;PdSIKI; Cloning; Expression; Drought stress

Abstract[Objective] The aim was to screen out drought resistance and water-savingPopulusdeltoides×Populusnigravarieties.[Method] WithPopulusdeltoides×Populusnigraasmaterials,drought resistancePdSIKIgene was cloned fromPopulusdeltoides×Populusnigraleaves with RT-PCR method then transferred into Arabidopsis thaliana, the phenotypic traits and physiological indicators were studied.[Result] The cDNA ofPdSIKIwas 2 442 bp and contained a single open reading frame of 813 amino acid residues.Protein sequence analysis showed thePdSIKIhas a serine/threonine protein kinase domain and transmembrane.Real time-PCR indicated that the mRNA accumulation ofPdSIKIwas strongly expressed in immature leaves,but not in functional leaves,roots and stem and induced by salt stress,ABA and drought.Additionally,compared with the control,transgenicPdSIKIarabidopsis performed stronger growth status. Chlorophyll content decreased and MDA content increased in drought stress.[Conclusion]PdSIKIgene can improve drought resistance ability ofArabidopsisthaliana.

基金项目科技部火炬计划项目(2012GH531899)；科技部星火项目(2013GA651006)。

作者简介杨李娇(1993- )，女，云南大理人，本科生，专业：生物技术。*通讯作者，讲师，博士，从事植物抗逆学研究。

收稿日期2016-02-25

中图分类号S 718.3

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)07-098-05