张倩勉， 黄海霞　(广西-东盟食品药品安全检验检测中心，广西南宁 530021 )



HPLC-MS法测定酱腌菜中的甜蜜素含量

张倩勉， 黄海霞(广西-东盟食品药品安全检验检测中心，广西南宁 530021 )

摘要[目的]研究测定酱腌菜中甜蜜素的含量，为酱腌菜中甜蜜素的快速测定提供参考。[方法]通过高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)方法，同时采用正负离子模式进行多反应检测(MRM)，对酱腌菜中甜蜜素的含量进行测定，用负离子模式的离子对为定量离子，并通过定性定量离子峰面积之比，参照欧盟标准偏差对结果进行判定，最后根据标准曲线采用外标法定量。[结果]试验表明，HPLC-MS法的标准曲线线性良好，相关系数r为0.999，检出限(3S/N)为0.05 mg/kg，回收率在90.2%～100% ，RD值为0.5%～1.1%。[结论] HPLC-MS法快速、简便、灵敏、准确，适宜酱腌菜中甜蜜素的快速测定。

关键词高效液相色谱-质谱联用法；酱腌菜；甜蜜素；含量

甜蜜素(sodium cyclamate)，化学名为环己基氨基磺酸钠，是食品生产中常用的合成甜味剂之一，其甜度为蔗糖的30～40倍，而价格仅为蔗糖的3倍，被广泛应用于饮料、果汁、冷冻饮品、蜜饯、糕点及酱腌菜等各类食品中。我国制作加盐酱腌菜历史悠久，品种丰富，产地遍及全国，有很多是富有特色、驰誉中外的产品，是我国美食的重要组成部分。但是我国的酱腌菜产业也存在一些问题，其中产品质量不稳定、甜味剂超标是常见问题。在酱腌菜中加入甜味剂能以最低的成本提升产品口味，所以很多不法商家为了追求更大的利润，会超量添加甜味剂。消费者如果经常食用甜味剂含量超标的产品，就会因摄入过量而对机体肝脏和神经系统造成危害，特别是对代谢能力较弱的老人、孕妇、小孩，危害更加明显[1]。所以，虽然甜蜜素是我国食品中广泛使用的甜味剂之一，但是我国对甜蜜素的使用有严格的限量，我国食品添加剂的最新国家标准GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》中规定，酱腌菜和盐渍菜中，甜蜜素不得超过1.0 g/kg[2]。所以，对酱腌菜中甜蜜素准确快速测定方法的研究有重要意义。

目前，酱腌菜中甜蜜素的测定主要应用GB/T5009.97—2003中第一法气相色谱法，其原理是环己基氨基磺酸钠在硫酸介质中与亚硝酸钠反应，生成环己醇亚硝酸酯，加入氯化钠和正己烷进行萃取，离心后利用气相色谱(FID检测器)法进行定性和定量[3]。但是该方法存在操作步骤繁琐、检出限不能满足酱腌菜中甜蜜素检测的要求等问题。

笔者采用HPLC-MS法测定酱腌菜中甜蜜素的含量，主要通过正负离子2种模式进行多反应检测，物质色谱峰的保留时间与标准工作液相应化合物的保留时间一致，且样品谱图中组分定性定量离子的相对丰度比与浓度相当标准工作液谱图中对应组分的定性定量离子的相对丰度比一致，允许偏差参照欧盟相关标准(2002/657/EC)。使用该方法测定酱腌菜中甜蜜素的含量更为准确、灵敏、高效。

1材料与方法

1.1材料原料及试剂：酱汁脆萝卜，抽检产品；甜蜜素对照品，含量为99.8%，xStandard公司；乙酸、甲醇，均为色谱纯；水为超纯水。

主要仪器设备：Agilent-1260高效液相色谱-Triple Quad 5500质谱仪，美国AB公司；S205DU分析天平。

1.2方法

1.2.1对照品储备液的制备。准确称取甜蜜素998.90 mg，置100 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，摇匀，即得甜蜜素对照品储备液，浓度为9.969 mg/mL。

1.2.2对照品工作液的制备。精密量取对照品储备液1 mL，置100 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得对照品中间液(浓度为99.69 μg/mL)。精密量取该溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得对照品工作液(浓度为0.996 9 μg/mL)。1.2.3标准曲线绘制。取5个10 mL容量瓶，分别加入对照品工作液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL，加水定容至刻度，摇匀，即得曲线L1、L2、L3、L4、L5，甜蜜素浓度分别为9.969、19.940、49.850、99.690、199.380 ng/mL。

1.2.4样品处理。

1.2.4.1供试品溶液制备。称取供试品5 g，置100 mL带塞比色管中，加水50 mL，超声30 min，冷却至室温，加水定容至刻度，摇匀，静置分层后，取1.0 mL上清液置另一100 mL离心管中，用水定容至刻度，摇匀，再吸取该溶液1.0 mL，置10 mL量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，通过0.22 μm滤膜过滤后，待上机分析。

1.2.4.2加标回收率试验。称取6份空白样品，每份5 g，分别置于6个100 mL量瓶中，分为3组，每组2份，第1组中分别加入40 μL对照品中间液，第2组中分别加入80 μL对照品中间液，第3组中分别加入150 μL对照品中间液。3组分别加水50 mL，超声30 min，冷却至室温，加水定容至刻度，摇匀，静置分层后，取上清液过0.22 μm滤膜过滤后，待上机分析。

1.2.4.3检出限溶液制备。取2份空白样品，每份5 g，分别置于2个100 mL量瓶中，分别加入1 mL对照品工作液，再加水50 mL，超声30 min，冷却至室温，加水定容至刻度，摇匀，静置分层后，取上清液过0.22 μm滤膜过滤后，待上机分析。1.2.5色谱条件。色谱柱：XBridge-C18(4.6 mm×75 mm，2.5 μm)；流动相组成为0.1%乙酸水溶液-甲醇，流速0.4 mL/min；柱温30 ℃；进样量1 μL。梯度洗脱，洗脱程序见表1。

1.2.6质谱条件。采用正负离子2种模式，离子源为电喷雾离子源；检测方式为多反应监测(MRM)；气帘气流速35 L/min；离子源温度650 ℃；碰撞气流速为6 L/min；辅助气流速为50 L/min；喷雾电压-4 500 V(正离子模式喷雾电压为5 500 V)；其余质谱条件见表2。

表2甜蜜素检测的质谱条件

Table 2The mass spectrometric conditions for determination of sodium cyclamate

1.2.7样品测定方法。将处理好的待测液放入自动进样器的样品盘上，进样器自动进样1 μL，数据采用Analyst Software工作站进行采集处理，采用Quantitative Analysis软件进行数据处理，使用外标法进行数据分析，得出样品溶液中甜蜜素的质量浓度，再根据以下公式得出检测结果。结果计算公式：

式中，W为样品中甜蜜素(以环己基氨基磺酸计)的含量(g/kg)；C为测得浓度(ng/mL)；V为稀释倍数；M为样品取样量(g);0.891为环己基氨基磺酸钠与环己基氨基磺酸的换算系数。

1.2.8检出限计算方法。将检出限溶液注入液质进行分析，并提取定性离子的信噪比，再根据以下公式计算出方法检出限。方法检出限计算公式：

式中，LOD为方法检出限(mg/kg)；C为进样浓度(ng/kg)；F为稀释倍数；W为样品取样量(g)；S/N为信噪比。

2结果与分析

2.1线性范围及回收率把标准品曲线注入液相质谱联用仪，以峰面积为(Y)轴，相对质量浓度为(X)轴建立标准曲线，并求出回归方程。结果显示(表3)，用液相色谱串联质谱检测甜蜜素在10～200ng/mL范围内线性关系良好，线性方程为Y=66 156X-310 123，相关系数R为0.999，能够满足定量分析的需要。回收率试验结果表明，甜蜜素加标回收率在90.2%～100%，RD值为0.5%～1.1%。

表3线性关系、相关系数和标准加入回收率

Table3Linearequations,correlationcoefficientsandrecoveriesofstandardaddition

2.2标准曲线、待测样品以及回收率峰面积之比把待测样品以及回收样品注入液相质谱联用仪，根据标准曲线计算出待测样品以及回收率的结果，并用定性定量离子峰面积之比对结果的准确性进行判定，结果偏差参照欧盟标准(2002/657/EC)。结果显示，所测物质以及回收率结果的定性定量离子峰面积之比均在标准曲线相应的定性定量离子峰面积之比规定的标准偏差范围内。所参照的标准偏差见表4，峰面积之比结果见表5。

2.3样品检测结果按照“1.2.4”对样品进行前处理，然后进样分析。用负离子模式的离子对为定量离子，并通过定性定量离子峰面积之比，参照欧盟标准偏差对结果进行判定，最后根据标准曲线采用外标法定量，计算样品中甜蜜素(以环己基氨基磺酸计)的含量，结果见表6。

2.4方法检出限在该试验条件下，在空白样品中添加标准溶液进行测定，进样浓度为9.969 ng/mL，取样量5.00 g,稀释倍数100倍，以质谱仪3倍信噪比(S/N，12.4)计算目标物组分的检出限，计算检出限结果为0.048 24 mg/kg，修约0.05 mg/kg。

3结论

通过该试验的结果分析可知，相对国标GB/T5009.97—2003中第一法气相色谱法，该试验所建立的高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS)测定酱腌菜中的甜蜜素操作步骤简化，检出限低。采用该方法测定酱腌菜中的甜蜜素，其标准曲线线性良好，相关系数为0.999，检出限(3S/N)为0.05 mg/kg，回收率在90.2%～100%，RD值为0.5%～1.1%。该方法可用于不同形态的酱腌菜中甜蜜素的测定，具有灵敏度高，分析速度快，前处理简单，检出限低等优点。

参考文献

[1] 杨保刚.我国酱腌菜行业质量调研报告[J].质量与标准化，2014(11)：31-32.

[2] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品添加剂使用卫生标准：GB2760—2014[S].北京：中国标准出版社，2015.

[3] 广州市卫生防疫站.食品中环己基氨基磺酸钠的测定:GB/T 5009.97—2003[S].北京：中国标准出版社，2004.

Determination of Sodium Cyclamate in Pickled Vegetables by HPLC-MS

ZHANG Qian-mian, HUANG Hai-xia

(Guangxi and ASEAN Inspection Testing Center for Food and Drug Safety, Nanning, Guangxi 530021)

Key wordsHPLC-MS; Pickled vegetables; Sodium cyclamate; Content

Abstract[Objective] The aim was to determine sodium cyclamate content in pickled vegetables, to provide reference for rapid determination of sodium cyclamate content in pickled vegetable. [Method] The positive and negative ions modes were selected for MRM by HPLC-MS, the ion pair of negative ion mode was quantitative ion and through the ratio of peak area between qualitative and quantitative ions according to the European standard deviation for determination. [Result] The results showed that a good linearity was obtained for the standard curve of the method, and its correlation coefficient was high(r=0.999). The detection limit was 0.05 mg/kg(3S/N). The recovery rate was between 90.2%-100%, theRDvalue was 0.5%-1.1%. [Conclusion] HPLC-MS method is rapid, simple, sensitive and accurate, which is suitable for rapid determination of sodium cyclamate in pickled vegetables.

作者简介张倩勉(1981- )，女，广西合浦人，工程师，硕士，从事食品安全检测研究。

收稿日期2016-02-14

中图分类号TS 207.3

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)07-076-03