宋俏姮，杨跃华，孔亮亮，刘俊峰

(四川省农业科学院水稻高粱研究所，四川德阳 618000)



玉米单倍体技术的利用研究与发展前景

宋俏姮，杨跃华，孔亮亮，刘俊峰

(四川省农业科学院水稻高粱研究所，四川德阳 618000)

摘要阐述了单倍体诱导技术在玉米育种中的应用优势、单倍体的诱导机理和遗传规律、玉米单倍体育种技术的必要环节以及国内的利用现状，同时讨论了目前单倍体技术应用的局限性和困难，并展望了该技术在鲜食玉米育种中利用的可能。

关键词玉米；单倍体技术；诱导育种；发展前景

我国是全球第二大玉米生产国和消费国，玉米产量和品质的提高需要不断改良发展育种手段。选育高产、高抗、高配合力的自交系是玉米育种中的基础和核心环节。单倍体育种是指利用植物单性生殖的方法，使其形成单倍体后通过自然或人为的方式对其染色体进行加倍，成为纯合二倍体(即纯系)，再从中选育新品种(系)的方法。单倍体诱导育种与常规育种手段相比具有明显优势：①它通过控制杂种分离，2个世代便可得到纯合二倍体，加快了自交系的选育，显著缩短了育种周期；②由于单倍体形成的二倍体是高度纯合的，没有显性性状的掩盖，通过植株就能直观地对隐性性状进行筛选，从而降低误选率，有效提高育种效率和节约育种成本；③能够与其他育种手段相结合，克服远缘杂交育种的不育，提高诱变育种的效率，形成的纯合二倍体可作为分子标记辅助育种和转基因育种的优良材料。因此，弄清单倍体的诱导机理和遗传规律，了解掌握国内单倍体诱导育种现状有助于更好地利用单倍体技术进行育种选系。

1单倍体的诱导机理和遗传规律

单倍体(haploid)指体细胞中只携带有配子染色体数目的个体。单倍体可自然发生，也可通过人为方式诱导产生，而单倍体的诱导机理目前仍没有明确的定论。学术界对此普遍持三大观点：①精核异型，认为有少量异常花粉存在于成熟的花粉细胞中，这部分花粉的2个精核形态1个正常，1个偏大未成熟或偏小已衰老，无法正常参与受精，这种单受精可能会诱发卵核产生单倍体胚；②染色体排除，在杂交过程中若双亲体细胞分裂周期不同步或者核蛋白质合成时间不同步，造成一方亲本的染色体丢失，形成单倍体[1]；③精核生殖单位的破坏，2个精细胞在花粉管中同时到达胚囊助细胞才能保证双受精，若2个精子分开运输，未能同步到达胚囊，只有1个精子参与了受精，与极核融合后可能发育成单倍体[2]。

单倍体只拥有1组染色体，所携带的所有基因都是单一的，但同时配子体是一个完整协调的新陈代谢体系，具有正常的生理功能。研究发现单倍体携带的基因在后代的分离是随机的，并且后代的基因型和表现型完全一致，无论是显性基因还是隐性基因控制的性状都能够真实直观的显现。单倍体通过对配子体直接进行选择，加倍后所得到的双单系的遗传组成100%纯合，具有稳定的遗传性，自交后代的数量性状等遗传变异也完全相同，不会出现性状分离[3]。

2单倍体技术体系和国内利用现状

常规育种手段选育玉米自交系需要6～8代，难以满足生产上对品种快速更新换代的要求。单倍体技术只需利用诱导系与目标材料杂交诱导、鉴选出单倍体、对单倍体二倍化即可获得100%纯合的自交系，该技术已成为国内外大型种子公司选系的重要手段，与分子标记辅助育种技术和转基因育种技术形成了现代育种技术新体系。我国对单倍体技术的利用起步较晚，但发展很快，获得了大量研究成果。

2.1单倍体诱导系的创制单倍体诱导途径有离体培养、利用射线或化学药物处理和活体诱导等。利用孤雌生殖诱导系杂交产生单倍体是一种诱导频率高、操作简捷、成本低廉的方法，易于在玉米育种中大规模推广[4]，优良的诱导系是单倍体技术的利用前提和基础。1959年Coe发现美国Northrup King公司的1份玉米材料作父本与其他玉米材料杂交后会产生一定比例的单倍体，为了从表型上区分出单倍体，导入籽粒色泽标记基因R-nj和植株色泽标记基因ABP1，将其命名为Stock6，这是第一个面世的单倍体诱导系[5]。国外学者在Stock6的基础上进行了不断改良，1988年法国Lashermes从W23ig和Stock6杂交产生的F3代选育出WS14[6]。KMS、ZMS、MHI、RWS等高频诱导系的创制，克服了Stock6的诸多缺陷。

我国第一个单倍体诱导系是1998年刘志增和宋同明通过Stock6与高油玉米改良群体BHO杂交选育出的农大高诱1号[7]，至此打破了国外对单倍体诱导系的垄断。此后国内综合性状优良、诱导频率高且稳定的单倍体诱导系不断被创制出来。陈绍江[8]通过农大高油高诱1号与UH400杂交组配，育成农大高诱2号、3号、4号、5号一系列新诱导系。才卓[9]运用Stock6和M278组配选育了吉高诱系3号。华中农业大学张姿丽和邱法展选育出诱导系HZI1[1]。广西农业科学院杨耀迥[10]通过B1和高诱1号杂交，育成Y8。目前国内单倍体诱导系的诱导率和抗病性均有提高，投入生产应用已成功得到双单倍体材料，然而研究发现由于目前创制的诱导系多为温带诱导系，在热带或亚热带利用时易出现诱导率不稳定、花粉量少、病害重等问题，且大多数是在Stock6的基础上选育，而用于改良Stock基础材料有限，限制了适应当地生态条件诱导系的创制。

2.2杂交诱导获得单倍体杂交诱导是单倍体育种的第一环，单倍体的数量关系到能否顺利开展后续步骤，为了尽可能多地获得单倍体，应选用诱导率高且稳定、遗传标记明显和综合性状优良的诱导系作父本，选择抗性佳、丰产性高、植株生长势强、品质优良的玉米材料作母本。苏月贵[11]利用Stock6诱导 20份热带硬粒型玉米材料，诱导率均值为2.84%，这与普遍认为Stock6的诱导率为3%的结论基本一致，而其变化幅度在0.84%～7.10%，推测原因为热带玉米种质的遗传背景不同。张如养[12]通过京科诱041、043、044、045和京科诱005、006分别与6个不同基础种质类型的自交系杂交诱导后，发现6个诱导系的诱导率均值差异极大，其中京科诱043诱导率均值最高，达6.06%，京科诱041和045诱导率最低，为2.45%，这种诱导率的差异可能是受到父本基因型的影响。江禹奉[13]通过高诱1号与6份热带玉米材料杂交诱导，结果显示高诱1号诱导率均值为1.66%。李国良[14]研究认为高诱1号的诱导率均值为3.90%，低于刘志增[7]的研究结果(5.8%)。孙瑞[15]比较了高诱1号、高诱5号和MT1、MT2与国内四大种质类群旅大红骨、瑞德、兰卡斯特、唐四平头杂交后诱导率的差异，结果表明高诱5号诱导率最高，均值达3.13%，苏娟娟[16]的研究显示高诱5号的诱导率为9.76%，显著高于另外3个诱导系，推测与母本种质基因型和种植条件有关。2014年刘丽[17]报道称不同玉米产区的诱导率存在差异，通过MT1诱导国内代表性玉米自交系后显示北方春播玉米区诱导率最高，为5.16%，其次为南方丘陵和西南山地玉米区，为5.14%，黄淮海夏播玉米区最低为4.44%。

单倍体诱导率的差异不仅受到诱导系自身诱导能力和稳定性的影响，同时与母本基因型和遗传背景、种植环境、授粉时花丝长度、育种者经验程度等因素有关，而诱导系与母本材料的合理搭配还需进一步探索。

2.3单倍体的筛选与鉴定单倍体的鉴定方法包括遗传标记鉴定法、形态学鉴定法、细胞学鉴定法、解剖学鉴定法、流式细胞仪鉴定法、分子标记鉴定法和生理生化鉴定法[18]。结合遗传标记和田间植株形态筛选玉米单倍体在实际操作中最为简便。诱导系携带的籽粒色泽遗传标记基因R1-nj，杂交诱导后获得的单倍体籽粒顶端糊粉层显紫色、胚部或胚芽尖无显色；若诱导系同时携有控制不定根、叶鞘、茎秆形成紫红色植株色泽标记基因ABP1-1，所诱导产生的单倍体后代幼苗叶鞘不显紫色[19]。研究认为理想情况下，运用籽粒和植株双显性遗传标记筛选出的单倍体准确率可高达98%，但仅通过花青素颜色基因来鉴定容易受到基础材料遗传背景、CI或Idf等色素抑制基因、籽粒成熟度和含水量、基因表达的剂量效应和操作者的主观判断等因素影响，结合田间表型特征能够显著提高鉴定结果的准确性。与正常的二倍体植株相比，单倍体植株较矮、生长发育慢、叶片颜色浅，雌雄花期往往不协调，雄穗不育或育性极低[20]。

高军[21]认为利用遗传标记来筛选玉米单倍体是最有效可靠的方法，可以有效避免肉眼通过植株形态鉴定所产生的误差。而Rober[22]研究提出籽粒色泽标记基因R1-nj在欧洲硬粒型玉米和热带玉米种质上的显色程度不佳。2003年陈绍江[23]运用高油分的花粉直感效应来筛选单倍体，由于农大高诱1号含油量高，花粉直感效应明显，以自交籽粒含油量为对照，杂交诱导后产生的籽粒用核磁共振仪测定油分含量，低于自交籽粒的即为单倍体籽粒，准确率达90%以上，该法适用于高油诱导系且后代遗传标记不明显的材料，如CHOI1。黎亮[24]提出可以通过流式细胞仪定量分析植物体内细胞DNA含量，快速准确筛选出单倍体，且不受取材部位限制。利用分子标记检测多态性差异，与母本带型一致的为单倍体，带型表现同时具有双亲基因型的为杂合二倍体。用显微镜镜检根尖或茎尖分生组织，通过染色体数目来判断单倍体也是一种准确有效的方法。准确地筛选出单倍体不仅依赖于育种家的经验技术，在生产实践中还需要根据具体育种情况灵活运用并不断予以丰富发展，以克服目前鉴定方法中固有的弊端和局限性。近年来自动化分拣技术受到了关注，例如运用计算机视觉技术系统通过籽粒的胚乳和胚部的颜色特征判别单倍体；利用核磁共振仪基于油分花粉直感效应原理开发出全自动分拣系统；通过近红外反射光谱结合SIMCA模型实现快速鉴选出单倍体等。

2.4单倍体的加倍单倍体植物高度不育，只有进行染色体加倍才能使其成为可育的二倍体。杂交诱导产生的玉米单倍体90%以上的雌穗均能够正常吐丝，然而一般情况下雄穗能自然恢复育性的不超过10%(不同基因型材料间差异很大)，因此单倍体雄穗育性问题是单倍体诱导育种应用中的限制性难题。研究认为，单倍体恢复二倍性或许是细胞的一种本能反应，但受到遗传背景和环境条件的影响，某些材料不发生自然加倍，依靠极低的自然加倍率很难满足育种实践，更多的需要进行人工处理以获得DH系[25]。

常用的人工加倍方法有浸种法、浸芽法、浸根法、注射法、涂抹法、包埋法和滴心法等。目前运用较多的是秋水仙素配以二甲基亚砜，通过浸种、浸芽、浸根或注射的方式[26]对单倍体进行处理，在细胞有丝分裂时期，打破纺锤丝的形成，使染色体不向两极移动而停留在赤道板附近，从而使有丝分裂失败而实现加倍[27]。刘俊[28]用0.06%秋水仙素与2.0%二甲基亚砜对不同基因型母本材料诱导产生的单倍体通过浸根法、滴心法、针刺生长点法进行加倍处理，结果显示针刺生长点法的加倍率最高，达23%。王贺[29]用0.07% 秋水仙素处理芽尖8 h，加倍率高达16.5%。韩学莉[30]发现0.05%秋水仙素处理时，浸种法和浸芽法药害率低但加倍效果较差，浸根法加倍率高同时药害较重，注射法最为理想。文科[31]研究认为浸根药害最重，浸种和注射加倍率较高，但注射法对植株伤害较重。加倍效果与环境、加倍方法和材料类型的关系密切，通常来讲浸种法是药害程度最低的办法，但其加倍效果还有待于进一步优化。秋水仙素为淡黄色剧毒粉末，在加倍实验中使用的浓度为0.02%～0.08%，需要专业人员小心操作。目前已有使用细胞分裂抑制剂(如APM、氟乐灵、拿草特、氨磺灵)、除草剂或一氧化二氮来替代秋水素的相关研究，然而加倍率不甚理想，未来期望发现更多无毒或低毒的高效加倍剂或加倍途径，以减少操作的危险性，并获得更好的加倍效果。

3展望

单倍体技术在玉米育种中的应用前景十分广阔，但同时在生产实践中也有其固有的局限性：①由于缺少常规育种各个分离世代遗传基因的交换重组，无法分离积累更多的优良基因型，不能有效打破不良基因连锁；②诱导系材料不足且诱导率不稳定，与不同基因型母本材料杂交诱导后差异显著；③诱导率低，可能是受到亲本遗传背景、种植环境、温度等因素的影响；④加倍率低，研究认为秋水仙素的处理浓度和时间与加倍率成正比，但与成活率成反比。为克服以上困难首先需要创制出适应当地生态条件的优良诱导系，在应用该育种技术时还需合理选择优良互补基因型亲本，快速有效地聚合有利基因，同时在适宜的环境和条件下种植以提高诱导率，并将人工处理温度、时间和试剂浓度合理配比，探索出适应特定组合的最佳加倍途径，将加倍得到的双单倍体种子在田间精密播种，妥善管理，通过植株长势、形状、籽粒色泽对双单倍体进行确认，将得到的DH系根据育种需要以去劣为原则进一步选择利用，同时与其他育种手段相结合以更好地应用于生产实践。

目前国内单倍体诱导育种技术主要是在普通玉米上利用，在鲜食玉米甜玉米、糯玉米、甜糯玉米上的利用研究相对较少，可供参考的文献和数据也比较匮乏。吕桂华[32]研究发现糯玉米和普通玉米材料诱导率高于甜玉米。李高科[33]通过Stock6与甜玉米杂交诱导后，在24 ℃条件下用0.02%秋水仙素浸泡种子32 h，成功获得了DH系，并用SSR标记对其纯度进行了鉴定。以上研究表明将单倍体技术应用于鲜食玉米具有可行性。运用该育种方法指导鲜食玉米的育种实践，能显著提高鲜食玉米材料创制过程中的准确性，为鲜食玉米双(多)隐性材料的创制提供一种新途径，符合改良鲜食玉米品质需求的发展趋势。然而同一单倍体诱导系分别与甜玉米、糯玉米、甜糯玉米杂交后的诱导率是否存在差异、哪种诱导系在鲜食玉米上的诱导效果更好、遗传标记基因在不同的鲜食玉米材料中显色程度如何、如何更好地提高鲜食玉米单倍体的加倍效果等问题都是目前亟需解决的，未来还需努力探索形成单倍体技术在鲜食玉米利用的新体系，以发挥单倍体技术在鲜食玉米育种中的利用优势。

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Utilization and Development Prospect of Haploid Breeding Technology in Maize

SONG Qiao-heng, YANG Yue-hua, KONG Liang-liang et al

(Rice and Sorghum Research Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Deyang, Sichuan 618000)

AbstractWe introduced the application advantage of haploid technology in maize breeding, induced mechanism and genetic regularity of haploid, necessary link for haploid breeding technology of maize, and the utilization status in China. At the same time, the limitations and difficulties of haploid technology application were discussed. The possibility of using this technology in the breeding of fresh edible maize was forecasted.

Key wordsMaize; Haploid technology; Induced breeding; Development prospect

基金项目四川省“十二五”农作物育种攻关甜、糯玉米杂交种选育子专题(2011NZ0098-2)；四川省“十二五”财政创新能力提升工程：甜糯玉米种质资源创新及新品种培育(2016ZYPZ-037)。

作者简介宋俏姮(1989-)，女，四川峨眉山人，研究实习员，硕士，从事玉米遗传育种研究。

收稿日期2016-02-20

中图分类号S 513

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)08-023-03