吕春荣，权国波，吴国权，洪琼花

(云南省畜牧兽医科学院，云南 昆明 650224)



撒坝猪成纤维细胞系的建立及其生物学特性分析

吕春荣1，权国波1，吴国权1，洪琼花*

(云南省畜牧兽医科学院，云南 昆明 650224)

摘要：实验采用撒坝猪耳缘组织块贴壁培养法首次对撒坝猪成纤维细胞进行体外培养，通过原代培养、传代培养、冷冻保存建立了撒坝猪耳缘成纤维细胞系；并对其细胞形态、细胞活率、细胞核型等生物学特性进行分析；还利用透射电镜观察了耳缘组织细胞。结果表明：细胞倍增时间为48 h，生长曲线为 “S” 型；染色体中正常二倍体染色体(2n=38)所占比例为 92.56%；细菌、真菌、病毒和支原体等微生物污染检测均显示为阴性。透射电镜观察显示，成纤维细胞呈长梭型。

关键词：撒坝猪；成纤维细胞系；生物学特性

资助项目：云高新产业发展(201404)项目

随着全球生物多样性及其遗传资源丧失程度的加剧，使得各国纷纷投入大量人力和财力，并以多种方式收集、保存和整理大自然赋予人类的宝贵财富，如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)，欧洲动物细胞培养物保藏中心(European Collection of Animal Cell Culture,ECACC)都相继保存了大量生物资源的培养物。

云南地方物种丰富，撒坝猪是云南省优良的地方猪种，耐粗饲、抗病力强、肉质好(味好鲜嫩)，为农民增收做出了极大的贡献，是较好的地方品种。作为我省的特色品种，为了更好地保护和利用撒坝猪遗传资源，非常有必要开展撒坝猪种质资源保存研究。与传统的活体保存相比，体细胞保存具有占用场地小、投资少、不受群体和个体生理利用年限制约、可以长期保存种质资源等优势。为加强撒坝猪这一独特地方品种保护，本试验以撒坝猪耳缘组织为材料，体外培养和建立了成纤维细胞系，并对其生物学特性进行了研究。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验材料：撒坝猪来源于楚雄州种猪场，试验用组织块来源于2月龄撒坝猪耳缘组织。

1.1.2主要试剂、仪器 ：胎牛血清(FBS)、高糖DMEM由 Gibco 公司生产。胰蛋白酶和青链霉素溶液购自Bioind 公司；一次性塑料培养皿为 Nunclon 公司生产。

主要仪器设备：CO2培养箱(Thermo)、倒置相差显微镜(Olympus，Nikon)、透射电镜(JEM-1011)、实体显微(Olympus)、细胞计数仪等。

1.2方法

1.2.1耳缘组织成纤维细胞的分离培养

撒坝猪耳缘组织剪毛后，用碘伏消毒，并用75%的酒精擦拭。取耳缘组织样本0.6 cm×0.6 cm，75 %酒精浸泡2 min，然后用生理盐水+1 %青链霉素溶液洗3 次，放入高糖DMEM+1%青链霉素中，放入4 ℃泡沫箱，确保24 h内带回实验室进行培养。超净台上剪刀刮去皮肤表面污物。PBS清洗4次后，用手术剪和镊子剪成碎块，放入直径为 50 mm 培养皿中，每皿 8 块左右进行培养。所用培养液为：高糖DMEM+10%FBS+1%青链霉素。最后放入培养箱(37 ℃，5% CO2，饱和湿度)中培养。每天在倒置显微镜下观察、照相，记录细胞迁移和增殖情况。

1.2.2成纤维细胞传代培养

当细胞长至培养瓶(皿)底壁80%左右时，PBS清洗3次，加入0.125%胰酶(含0.01%EDTA)37 ℃消化5 min后，倒置相差显微镜下观察。当细胞开始变圆时，加细胞培养液终止消化，吹打细胞使其完全脱落，以1∶2或1∶3的比例进行传代。倒置相差显微镜下观察传代细胞生长增殖状况，并拍照。传代培养液与原代培养液相同。

1.2.3成纤维细胞冷冻与复苏

胰酶消化收集细胞，1 200 r/min 离心5 min，弃上清，用冻存液调整细胞浓度为 1～3×107/ mL 左右，充分混匀，分装于冻存管中。标明细胞名称、冻存管编号、性别和冻存日期。-80 ℃冰箱过夜，次日投人液氮罐中长期保存[1]。细胞冻存液为高糖DMEM + 30% FBS +10%二甲基亚砜(DMSO)。

细胞复苏时将冻存管从液氮中取出，迅速投人42 ℃水浴锅中 1 min，不停摇动使其受热均匀。转移至离心管中离心，弃上清，加入细胞培养液重悬细胞。移至培养瓶中，在37 ℃、5%CO2的培养箱中培养[2]。倒置显微镜下观察复苏细胞生长状况，并拍照。

1.2.4耳缘组织透射电镜观察

撒坝猪耳缘组织剪毛后，用碘伏消毒，并用75%的酒精擦拭。用消毒好的耳号钳取材后，用锋利的手术剪立即剪小并放入装有3.5%戊二醛的离心管中固定，放入4 ℃泡沫箱，送昆明医学院电镜中心进行透射电镜分析。

1.2.5成纤维细胞生长曲线测定

取传至第2代的撒坝猪成纤维细胞，胰酶消化后，制成单细胞悬液，调整细胞密度为1×105个/孔，接种于24孔培养板。从第2天开始到细胞长满，每天随机取3 孔，连续7 d 记数。用血球计数板在倒置相差显微镜下计数，取其平均值，以时间(d)为横坐标，细胞数为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.2.6撒坝猪成纤维细胞的核型检测

取培养至汇合度为85%左右，并处于对数生长期的细胞为试验材料，参照Sun Y L[3]方法进行染色体制备。

1.2.7细胞活率测定及微生物检测

对冻存前后的第 2、4、6 代细胞进行PI染色，统计计算细胞存活率。微生物检测参见 Doyle[4]，Hay RI[5]和 Guan[6]等。

2结果与分析

2.1撒坝猪成纤维细胞形态学观察

组织块培养5 d左右，成纤维细胞和少量类上皮细胞从组织块周围移出生长。随着培养时间延长，大量成纤维细胞从组织块周围迁出并迅速增殖，成纤维细胞呈典型的长梭形。当细胞长至培养瓶(皿)底壁80 %左右时，进行消化并传代培养。细胞传代后，生长加快，3～4 d 细胞即可长满瓶底而再次传代。原代细胞及传代后细胞的培养结果见图1。

图1　撒坝猪成纤维细胞A：原代细胞(20 X)B：第5代细胞(20X)

2.2撒坝猪耳缘成纤维细胞冻存前及复苏后细胞活率

撒坝猪耳缘组织成纤维细胞冻存前活率为94.16 %，复苏后活率为91.12 %，细胞在冻存前和复苏后都有较高的存活率，达到90 %以上，表明细胞在生长时健康状况良好，培养条件适宜。另外，冻存对其存活率影响不大。

2.3撒坝猪耳缘组织透射电镜分析

撒坝猪耳缘组织透射电镜分析结果如图2所示：细胞与细胞之间排列疏松，无紧密连接和桥粒，胞质内有丰富的细胞器，胞核呈长梭形，常染色质较为丰富。图2A黄色箭头所示为表皮层和真皮层的皮肤类细胞，为椭圆形。图2A、2B红色箭头所示为位于基底层的成纤维细胞，为长梭型。

图2　撒坝猪耳缘组织透射电镜分析(黄色箭头所示皮肤类细胞，红色箭头所示为成纤维细胞)

2.4撒坝猪成纤维细胞生长的动态观察

每天计数结果取平均值，绘制撒坝猪成纤维细胞生长曲线呈“S”型(图3)，细胞有约3d的缓慢生长期。此后进入指数生长期，第7天细胞数达最大。然后细胞生长进入平顶期，此时由于细胞密度增大，细胞生长受接触抑制的影响，细胞开始衰老凋亡。

图3　撒坝猪成纤维细胞的生长曲线

2.5撒坝猪成纤维细胞核型分析

参照 Levan[7]等的标准，第 3 代细胞核型取 100 个分裂相进行统计分析。结果显示，撒坝猪染色体中正常二倍体染色体 (2n=38)所占比例为92.56%。说明所培养的细胞遗传性能稳定，该细胞系为稳定的二倍体细胞系。

图4　撒坝猪核型图(母)(1000x)

2.6撒坝猪成纤维细胞系微生物污染检测结果

2.6.1细菌、真菌污染检测结果

接种细胞的液体培养基和阴性对照一样，没有混浊，而阳性对照表现有明显微生物生长。

2.6.2病毒检测结果

红细胞吸附实验结果为阴性。日常相差显微镜观察，未见有病毒造成的细胞损伤现象。

2.6.3支原体检测结果

实验采用Hoechst 33342 DNA 荧光染色法，未检查到撒坝猪成纤维细胞被支原体污染。实验组细胞经Hoechst33342荧光染色后，仅细胞核显色，细胞表面及细胞周围干净、清晰，无荧光小点。如图5 A所示。阳性对照组经Hoechst33342荧光染色后，可见细胞核与细胞膜及其周围均可见散在的蓝色荧光颗粒所图5 B所示。证明我实验室建立的撒坝猪成纤维细胞系支原体检测呈阴性。

图5　撒坝猪成纤维细胞支原体检测

3讨论

据张利娟等[8]报道，猪的染色体数目为2n=38。我们的实验结果表明撒坝猪的染色体数目为2n=38，与上述结论一致。撒坝猪成纤维细胞体外培养中，随着传代次数的增加，生长速度会变慢。此外，细胞的二倍体染色体数目正常的比例呈逐步下降的趋势，细胞遗传稳定性有所改变。可能是由于细胞本身端粒酶长度的缩短[9]或者体外培养环境对细胞的 DNA 造成的损伤[10]。而本实验要求培养的细胞始终维持二倍体生物学性状，保持与体内细胞相似性较大，因此不能传代太多，传2～3代细胞不用于实验就立即低温冻存。对原代细胞以及复苏后细胞中染色体众数进行检测，2n=38 的占90 %以上，染色体没有异常表现，说明该细胞系为稳定二倍体细胞系。

核型制备过程中，固定和滴片是核型分散成功的保证[11]，适当的滴片高度也是染色体分散良好的重要条件[12]。撒坝猪成纤维细胞核型制备时，用0.25 μg /mL 终浓度的秋水仙胺处理细胞2.5 h，低渗40 min，1.5 m 滴片，能够得到分散度好、数量多的细胞中期染色体。撒坝猪染色体长度的测定计算中，实验对多个中期染色体分裂相进行了观察、分析、比对。实验结果表明，撒坝猪的染色体 2n=38，与其它猪的染色体相似[8]。

本研究从撒坝猪耳缘组织中分离、培养并建立了成纤维细胞系。通过形态学观察结果看，细胞为长梭形，绝大多数是成纤维细胞，其中含有少量其他类型的细胞，如上皮细胞。由于上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶耐受性不同[13，14]。因此，利用此差别，通过几次传代后，就可得到纯化的成纤维细胞。

低温保存技术是生物科学的一门分支学科，是指将体外培养物悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定冷冻速率(或不同温度梯度应用不同的冷冻速率，并且有一定的保持时间)降至零下某一温度(一般是低于-70 ℃的超低温)，此温度能够维持生物样本活性暂停，进而可以长期保存[15]。细胞保存过程中，需要尽可能降低细胞内冰晶的形成，从而保持解冻后细胞活性、黏附能力及代谢活性[16]。本试验采用10%DMSO加培养液来冻存细胞，冻存前细胞活率为94.16%，复苏后的细胞活率91.12%，细胞复苏后10～15 h 可见细胞贴壁；复苏后第2天更换培养液，2～3 d 长满培养瓶。说明冻存的各项条件对细胞损伤不大，撒坝猪成纤维细胞可在液氮冻存，解冻后细胞可继续传代培养，活率与冻存前相比相差不大。可以用该法保存撒坝猪这种优良的动物遗传资源。

综上所述，本研究建立的撒坝猪耳缘组织成纤维细胞系增殖快，遗传性质稳定。该细胞系的建立，使撒坝猪这一国家重要遗传资源在细胞水平上得以保存下来，并为相关遗传学研究提供了有效的理论依据和理想的生物材料。同时对于开展其他动物成纤维细胞系的建立也有一定的理论和技术指导意义。

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Establishment and the Biological Characteristics of Fibroblast Cell Line in Saba Pig

LV Chun-rong1，QUAN Guo-bo1，WU Guo-quan1，HONG Qiong-hua*

(Yunnan Animal Science and Veterinary Institute, Kunming 650224，China)

Abstract：In this study，the fibroblasts cell line derived from ear marginal tissue of saba pig was successfully established using the primary explants technique and cryopreservation technology.The morphology，cell survival rate and karyotypes of the cultured cells after different passages were analyzed，The tissue cells of the ear were observed by transmission electron microscopy.The results showed that the population doubling time(PDT)of the cells was 48 h；The growth curve of the cultured cells appeared“S”shape；The frequency of cell chromosome number to be 2n=38 was 92.56 %；Tests for the contamination from bacteria，fungi or mycoplasma were negative；Transmission electron microscopy showed that fibroblast cells were long shuttle type.

Key words：saba pig；fibroblast cell line；biological characteristics

通讯作者：洪琼花(1968-)，女，白族，硕士，研究员，主要从事绵羊、山羊的育种和高效繁殖新技术研究。E-mail：yxh7168@126.com

作者简介：吕春荣(1982-)，女，云南人，硕士，助理研究员，研究方向动物细胞分子生物学。E-mail：chunronglv228@163.com

收稿日期：2015-12-23

中图分类号：S828；S814.3

文献标识码：A

文章编号：1005-2739(2016)02-0009-05