吴　多，周　艳，宋傲群，刘　浏，史筱靓，姜孝成

(湖南师范大学生命科学学院, 中国 长沙　410081)



利用靶拟态合成和Gateway技术构建水稻miR164c沉默突变体

吴多**，周艳**，宋傲群，刘浏，史筱靓，姜孝成*

(湖南师范大学生命科学学院, 中国 长沙410081)

摘要以水稻基因组DNA为模板， PCR扩增得到与miR399互补的OsMIM399后，改造成与miR164c互补的靶拟态序列OsMIM164c，经测序分析后连入pGWC载体，获得入门载体pGWC-OsMIM164c；利用Gateway技术，将入门载体pGWC-OsMIM164c经LR反应连接到植物表达载体GCS中，获得GCS-OsMIM164c表达载体，经农杆菌介导将该表达载体导入水稻品种Kasalath的愈伤组织中，组织培养后获得再生植株并进行目的基因的PCR鉴定， Real Time PCR方法检测阳性突变体植株中miR164c的表达量. 研究结果表明，miR164c在突变体植株中的表达量显著低于野生型，说明miR164c沉默突变体构建成功.

关键词靶拟态; Gateway技术; miR164c; 沉默突变体; 水稻

Construction of Silence Mutant ofmiR164cinOryzaSativaL.by Target Mimicry and Gateway Technology

WUDuo**,ZHOUYan**,SONGAo-qun,LIULiu,SHIXiao-liang,JIANGXiao-cheng*

(College of Life Sciences, Hunan Normal University, Changsha 410081, China)

AbstractGenomic DNA of rice (Variety ZR02) was used as template to amplifyOsMIM399 by PCR which has a region complementary tomiR399, andOsMIM399 was reconstructed into the target mimicryOsMIM164cwith a region complementary tomiR164c. After sequencing, the right fragment was ligated into pGWC vector to construct pGWC-OsMIM164c, andOsMIM164cwas then transferred to the plant expression vector GCS to prepare GCS-OsMIM164cthrough LR reaction. GCS-OsMIM164cwas finally transformed into rice Kasalath calli by the improved Agrobacterium-mediated method and regenerated plantlets were obtained by tissue culture technique. After target geneOsMIM164cwas identified by PCR, the expression ofmiR164cin positive mutants was analyzed by RT qPCR. The results showed that the expression ofmiR164cexhibited a distinct reduction in mutant plants compared to the wild type, indicating that themiR164csilence mutant has successfully been prepared.

Key wordstarget mimicry; gateway technology;miR164c; silence mutant; rice

microRNA(miRNA)是一类长度为20~24 nt的非编码小分子RNA，在转录后水平对靶mRNA进行剪切或抑制其翻译，继而调控靶基因的表达[1]. 每个miRNA家族中有多个成员，各成员核苷酸序列极其相似，对基因的调控作用表现出冗余效应. 因此，沉默其中一个miRNA很难出现预期的表型；通过常规的构建基因沉默载体方法来研究miRNA的功能丧失(lose-of-function)存在很大困难[2]. 2007年，Jose等在研究低磷诱导下miR399的功能时，发现一个非编码的基因IPS1，它是TPS1大家族中的一员.TPS1家族成员都含有一段非保守的短开放阅读框(ORF)，具编码四肽(Met-Ala-Ile-Pro)的功能[3-6]；另一个共同特征是含有一个保守的23 bp的基序，该基序与miR399可形成不完美配对，即配对时在第10~11座位错配而出现一个突起环，致使IPS1可以与miR399特异结合而不被切割，因此，过表达IPS1可导致miR399的功能沉默，从而导致miR399的靶基因PHO2的表达上调. Jose把这个抑制miRNA活性的机制称为“靶拟态(target mimicry)”，并通过制造人工靶拟态抑制了相关miRNA的活性[7]. “靶拟态”机制使得专一性抑制目的miRNA的活性成为可能，为研究miRNA的功能提供了新的策略和方法.

目前普遍采用高通量基因克隆技术(Gateway Cloning Technology，简称Gateway技术)以获得目的基因的沉默突变体[8]. 该技术在被称为“入门克隆(Gateway Entry Clone)”中目的DNA片段的插入位置两端分别整合att L1和att L2侧翼重组序列(Flanking Recombination Sequence)，形成一个类似通道的结构. 入门克隆与表达载体可以通过LR反应(即在LR反应酶作用下入门克隆的目的基因两端的attL1和attL2位点与表达载体的attR1和attR2位点发生定向重组)，从而将目的基因转移到表达载体. 该方法无需进行限制性内切酶酶切等操作，简易高效.

在前期研究中，作者发现人工老化处理的水稻种子随着活力下降，其胚中miR164c的表达量上调，因此推测miR164c可能参与水稻种子活力的调控[9]. 作者试图整合靶拟态合成技术和Gateway技术，制备水稻miR164c沉默突变体，为进一步研究miR164c调控种子活力的分子机制奠定基础.

1材料与方法

1.1材料

水稻Kasalath、水稻ZR02、大肠杆菌(Escherichiacoli)TOP10、农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)Ag10和EHA105(湖南师范大学植物发育与分子生物学实验室提供)；pGWC Vector，GCS-AsRed-pCambia1301-UbiN Vector(北京大学生命科学学院邓兴旺实验室惠赠). 限制性内切酶AhdⅠ(Fermentas公司)，Gateway LR Clonase Enzyme Mix(Invitrogen)，反转录系统及All-in-One miRNA Detection Kit(GeneCopiea公司)，PrimeSTAR HS DNA聚合酶、质粒提取及胶回收试剂盒(上海生工生物公司)，TRIzol及引物的合成(Invitrogen)，其他为国产或进口分析纯试剂.

1.2方法

1.2.1OsMIM164c的制备

1)引物设计以水稻基因组数据库中序列IPS1为模板，运用primer 5.0软件设计引物Os-IPS1-F(Primer A)和Os-IPS1-R(Primer B)，见表1；将IPS1中本来与miR399互补的序列(图1)替换为与miR164c互补的序列(图2)，在IPS1的上、下游分别设计引物Os-IPS1-miR164c-F(Primer C)和Os-IPS1-miR164c-R(Primer D)，然后在引物 C的5′端加上需要改造的碱基TCTA,引物 D的5′端加上需要改造的碱基TAGA(TAGA与TCTA彼此反向互补配对)，见表1.

表1　本文PCR反应所用的引物

注：带下划线部分为与miR399互补的序列图1　OsIPS1的序列Fig.1　The sequence of OsIPS1

注：带下划线部分为与miR164c互补的序列;引物设计(背景颜色对应于上述OsIPS1的相应部位)：Os-IPS1-F(Primer A)　5′-GCAGAAAGCCCCTCAAATCTCAAAGAGGCACCAATAC-3′Os-IPS1-R(Primer B)　5′-GGCACACACAATCTTAATTACTAATATCAAATTCATC-3′Os-IPS1-miR164c-F(Primer C)　5′-TGCACGTACC TCTA TGCACGTACCATTATTCGGTGGATG-3′Os-IPS1-miR164c-R(Primer D)　5′-TGGAGAAGCA TAGA GG TAC GTG CA CCTTAGTAGAGGTAA-3′其中，带“____”部分为改造的与目的miRNA互补配对的片段； 带“”部分为不与miRNA互补配对而设计的碱基图2　改造的与miR164c互补的 IPS1序列Fig.2　The remoulded sequence of IPS1 complementary to miR164c

注：带“____”部分为与miR164c互补配对的序列，为不与miR164c匹配的部位,带波浪线部分为BglⅡ的切割识别部位图3　OsMIM164c序列Fig.3　The sequence of OsMIM164c

2)重叠PCR制备OsMIM164c按陈锐等的方法[10]进行.以水稻ZR02叶片为材料，CTAB法[11]提取基因组DNA，以引物(Os-IPS1-F与Os-IPS1-R )PCR获得OsIPS1片段；以OsIPS1为模板，引物(Os-IPS1-miR164c-F与Os-IPS1-R)PCR获得OsIPS1-3′端片段；用引物(Os-IPS1-miR164c-R与Os-IPS1-F)PCR扩增获得OsIPS1-5′端片段；(扩增用pfu酶)；以OsIPS1-3′端片段和OsIPS1-5′端片段为模板，加入引物(Os-IPS1-F与Os-IPS1-R)和dNTP及pfu酶，进行30循环PCR，胶回收获得OsMIM164c片段.

1.2.2pGCW-OsMIM164c入门载体构建构建带OsMIM164c的pGCW入门载体步骤如下： (1)酶切反应：pGCW空载体 7 μL，Buffer 0.2 μL，ddH2O 10 μL，AhdⅠ1 μL，混匀后37 ℃水浴 5 h. (2)电泳：1%琼脂糖凝胶电泳，回收大片段. (3)连接：用回收纯化后的带有AhdⅠ酶切位点的OsMIM164cPCR产物与pGWC酶切片段通过快速连接酶在16 ℃水浴锅中连接1 h.(4)转化：连接后转导入感受态细胞TOP10中，混匀，冰浴 2~3 min；42 ℃热激 90 s，再冰浴 2~3 min；加入2 mL LB 培养基，于 37 ℃振荡培养 45 min.(5)培养：取适量菌液均匀涂布于 LB 平板(含氯霉素12.5 mg/L)，培养皿倒置于培养箱中，37 ℃培养过夜，再挑取菌落划线培养.(6)PCR鉴定：挑选阳性克隆进行PCR鉴定后，铂尚生物技术(上海)有限公司测序确认.

选取测序正确的克隆制备质粒. 挑取相应的阳性菌落，分别接种于5 mL LB液体培养液中 (含氯霉素12.5 mg/L)，37 ℃振荡培养过夜后，参照SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒说明提取质粒. 1%琼脂糖凝胶电泳检测，-20 ℃保存.

1.2.3构建GCS-OsMIM164c表达载体LR反应创建表达载体GCS-OsMIM164c. 在0.2 mL的离心管中加入以下反应体系(10 μL)：3.5 μL入门载体pGWC-OsMIM164c，1.5 μL植物空表达载体GCS，1 μL Buffer，1.5 μL LR酶，2.5 μL ddH2O. 混匀，瞬时离心后，25 ℃水浴1 h；取3 μL 反应液转导入感受态细胞TOP10中(方法同1.2.2)，取适量菌液涂布的LB平板(含潮霉素30 mg/L)上，涂布均匀后，培养皿倒置于培养箱中，37 ℃ 恒温箱中过夜培养. 转化后挑取菌落划线培养，筛选阳性克隆，提取质粒(方法同1.2.2).

植物表达载体GCS-OsMIM164c酶切鉴定: 反应体系20 μL：GCS-OsMIM164c7 μL，BglⅡ1 μL， Buffer 0.2 μL， ddH2O 10 μL. 37 ℃ 水浴锅，酶切6~8 h，1%琼脂糖电泳(5 V/cm)检测.

1.2.4农杆菌介导GCS-OsMIM164c遗传转化水稻Kasalath参照周艳[12]的方法.

1.2.5突变体植株的分子鉴定选取T0代抗性植株，采用CTAB[11]法提取水稻基因组DNA，根据GCS-IPS1的嵌合片段设计上游引物P-GCS-F，根据目的基因设计下游引物P-IPS1-R，引物序列见表1，进行PCR扩增.

1.2.6RT-qPCR分析取水稻组织(叶、茎或种子等)样品100 mg，液氮研磨至粉末状，迅速转移至预冷的1.5 mL EP管中，采用TRIzol法提取总RNA. 非变性琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计检测后，按All-in-One miRNA Detection Kit(GeneCopoeia)说明操作，合成cDNA第一链. 根据Pre-miR164c序列设计RT-qPCR正向引物Os-miR164c-F，并以Os-5.8s为内参基因(正向引物为Os-5.8s-F)，引物序列见表1，反向引物采用试剂盒中的通用引物. 以反转录得到的cDNA为模板，按Thermo Scientific PCR0096 Real-time PCR系统的说明操作，PCR反应重复3次. RT-qPCR检测的反应体系10 μL：2×All-in-One qPCR Mix 5 μL，正、反向引物(0.2 μmol/L)各1 μL，diluted cDNA(1∶5)1 μL，ddH2O 2 μL. 荧光定量PCR扩增程序：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，40个循环，最后以每6 s上升0.5 ℃的速度从65 ℃到95 ℃记录熔解曲线，实验数据用Piko Real Software2.0分析.

2结果和分析

2.1OsMIM164c目的片段和GCS-OsMIM164c载体的鉴定

以水稻ZR02的基因组DNA为模板扩增得到的OsIPS1片段预期大小656 bp. 运用重叠PCR技术将OsIPS1改造为与miR164c不完全互补的片段OsMIM164c，改造后片段与IPS1大小一致(图4), 测序结果符合预期. 将GCS-OsMIM164c用BglⅡ进行酶切后电泳检测，结果如图5所示，图中1 580 bp左右的条带与预期一致，表明目的片段已经成功连入载体，表达载体构建成功.

2.2miR164c沉默突变体的分子鉴定

挑取9个转基因株系，分别提取其叶组织的基因组DNA，以GCS-OsMIM164c做阳性对照，野生型做阴性对照. 结果表明，其中8个株系扩增出特异性目的条带(图6)，说明已成功获得了miR164c沉默突变体.

2.3沉默突变体的miR164c表达量分析

运用SYBR Green I染料法对miR164c沉默突变体的叶、茎和种子中的miR164c表达量进行RT-qPCR分析(分别以野生型的叶、茎和种子作对照). 结果表明，miR164c在沉默突变体的三类组织器官中的表达量均比野生型低(图7).

M. DNA marker； 1. OsMiM164c　　　　　　　　　　　M. DNA marker; 1. BglⅡ酶切质粒; 2. 非酶切质粒　　　　　　　　图4　OsMIM164c的电泳鉴定　　　　　　　　　　　图5　GCS-OsMIM164c的酶切鉴定　Fig.4　Electrophoresis identification of OsMIM164c on 1.0% agarose gel　　　Fig.5　BglⅡ digestion identification of GCS-OsMIM164c

M. DNA Marker; P. GCS-OsMIM164c; WT. 野生型; 1-9.转基因株系图6　T0代转基因株系GCS-OsMIM164c嵌合片段的PCR鉴定Fig.6　PCR identification for the chimeric fragment of GCS-OsMIM164c of T0 transgenic lines

图7　水稻Kasalath miR164c沉默突变体和野生型不同组织器官中miR164c的表达量比较Fig.7　Comparison of the expression of miR164c in different tissues of miR164c silence mutant and wild type of rice Kasalath

3讨论

miRNA的作用方式主要是转录后调控靶基因，广泛参与植物生长发育、抗逆性等方面. miRNA靶拟态(target mimicry)能够有效地抑制相关miRNA的活性. 通过定向改造IPS1基因构建人工miRNA靶拟态(Target mimicry)来下调miRNA表达，已成为研究miRNA功能的一种重要方法. Todesco等[13]利用靶拟态技术已经成功构建了在拟南芥中表达的MIM156,MIM157,MIM159,MIM160,MIM164,MIM167,MIM170,MIM172和MIM319等靶拟态突变体株系，使相应的靶miRNA表达量显著下调并获得明显表型. 水稻是单子叶模式植物，吕明芳[14]用靶拟态技术获得了沉默miR156功能的植物转化载体. 本研究改造水稻的IPS1序列，使其与miR164c配对时形成一个错配环，获得了OsMIM164c. 荧光定量PCR结果表明，突变体植株中miR164c的表达量在叶、茎和种子中均明显下调.

Gateway技术是invirtogen公司开发的一种高通量克隆技术，已被广泛运用. 比如，徐化学等构建了水稻基因OsDAD1基因的RNA干扰载体[15]；耿卫东等构建了棉花GhSAMDC基因RNA干扰载体和过表达载体[16]；郭姗姗等构建了植物表达载体p1104D[17]；高东尧等构建了含有双35S启动子的高效表达载体以验证小麦穗发芽抗性相关Vp-1基因的功能[18]；何敏等构建了靶向人Akt基因的shRNA表达载体[19]等等. 该技术可以将入门克隆的重组片段(目的基因)转移到各种不同的表达载体中，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而不影响同步表达克隆的测序结果；在使用每一种新的表达系统时，能节省更多的时间. 此外，Gateway构建过程没有限制性内切酶和连接酶的参与，比普通酶切法的转化效率高. 因此，该方法具有操作简便、反应条件容易控制、反应后阳性克隆易于检测的特点，适合大规模的载体构建，为高通量地研究植物基因功能提供了有力支持. 另外，利用该技术构建的是一种二元载体，可以直接用于农杆菌介导的植物转化.

本文通过整合靶拟态技术和Gateway技术，快速高效获得了miR164c的靶拟态沉默突变体，通过PCR检测，阳性率高达89%， 为进一步探讨miR164c对水稻种子活力调控的分子机制及其他生物学功能奠定了基础.

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(编辑WJ)

中图分类号Q785; Q943.2

文献标识码A

文章编号1000-2537(2016)01-0024-06

*通讯作者,E-mail：jxclc@hunnu.edu.cn

基金项目：国家自然科学基金资助项目(31071487，31270348)；湖南省生态学重点学科建设项目(0713)；湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目(2014-76)

收稿日期：2015-03-31**本研究工作同等贡献者.

DOI:10.7612/j.issn.1000-2537.2016.01.005