张海英，李伟，周龙龙，姜林，周铭心.新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐 8300；.新疆医科大学附属中医医院，新疆 乌鲁木齐 830000



新疆阿魏抗肿瘤活性部位筛选

张海英1，2，李伟2，周龙龙1，姜林2，周铭心1
1.新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学附属中医医院，新疆 乌鲁木齐 830000

摘要：目的筛选新疆阿魏抗肿瘤的活性部位。方法采用溶剂法将新疆阿魏分离成不同极性部位，磺酰罗丹明B法检测各部位对肿瘤细胞的增殖抑制作用，流式细胞术分析各部位诱导肿瘤细胞凋亡的作用。结果新疆阿魏石油醚部位无抗肿瘤活性，新疆阿魏乙酸乙酯部、正丁醇部对人结肠癌细胞HCT116、人结肠腺癌细胞Caco-2、人肝癌细胞HepG2、小鼠肾癌细胞MFC均有不同程度的增殖抑制和促凋亡作用，甲醇部位活性较弱。结论乙酸乙酯、正丁醇部位有较强的抗肿瘤活性，可确定为新疆阿魏抗肿瘤活性部位。

关键词：新疆阿魏；抗肿瘤；活性部位；细胞凋亡

阿魏属隶属伞形科前胡族，约有150余种，主要分布于地中海、中亚及其邻边地区，我国有31种，其中新疆产25种[1]。2010年版《中华人民共和国药典》收载阿魏为伞形科植物新疆阿魏Ferula. sinkiangensis K.M.Shen或阜康阿魏Ferula. fukanensis K.M.Shen的树脂，味苦、辛，性温，归脾胃经，具有消食、化癥、散痞、杀虫之功效[2]。近年来由于发现阿魏有植物雌激素作用和抗癌活性而倍受人们关注。新疆少数民族用其治疗胃肠道肿瘤，研究表明阿魏同属植物有明确的抗肿瘤作用[3-5]。

本研究采用不同极性溶剂将新疆阿魏分为石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇4个部位，采用磺酰罗丹明B（SRB）法检测不同部位对肿瘤细胞的增殖抑制作用，流式细胞术检测新疆阿魏不同部位诱导肿瘤细胞凋亡的作用，初步确定新疆阿魏抗肿瘤活性部位。

1　实验材料

1.1细胞株

人结肠癌细胞HCT116、人肝癌细胞HepG2、小鼠胃癌细胞MFC、人结肠腺癌细胞Caco-2，中国科学院上海细胞研究所提供，实验使用细胞为5～10代。

1.2药物

新疆阿魏药材为伞形科植物新疆阿魏Ferula sinkiangensis K.M.Shen的树脂，经新疆伊犁州食品药品检验所检验合格，批号20120004。

1.3主要试剂与仪器

DMEM高糖、RPMI1640培养液（美国Gibco公司，批号1346370、1237839），胎牛血清（美国Hyclone公司，批号F120121），SRB（美国Sigma公司，批号20223FAV），三氯乙酸（分析级，天津市百世化工有限公司，批号20100102），乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、30～60 ℃石油醚均为分析纯。超净工作台（中国上海智诚ZHJH．C1112B），酶标仪（美国Thermo公司），二氧化碳培养箱（美国Thermo公司），流式细胞仪（美国MILLPORE公司，GUAVA EASYCYTE8HT），10 mL移液管、5 mL移液管、100 mm细胞培养皿、6孔板、96孔板（美国COSTAR公司），移液器（德国Eppendorf公司）。

2　实验方法

2.1新疆阿魏不同极性部位的分离

新疆阿魏400 g，用30～60 ℃石油醚2000 mL超声提取40 min，控温在40 ℃以下，相同方法提取1次，过滤，浓缩，60 ℃干燥，至无气泡产生，即得石油醚部位。上述残渣再用95%乙醇2000 mL超声提取2次，过滤，合并提取液，减压浓缩。浓缩的膏液用硅藻土拌样分散均匀后，用乙酸乙酯2000 mL超声提取2次至提取液近无色，减压回收得乙酸乙酯部位；继续用水饱和正丁醇2000 mL超声提取2次至提取液近无色，减压回收得正丁醇部位；用甲醇2000 mL超声提取2次至提取液近无色，减压回收得甲醇部位。

2.2磺酰罗丹明B法检测

HCT116、HepG2、MFC、Caco-2细胞用加10%胎牛血清的RPMI1640培养基、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素在37 ℃二氧化碳培养箱中培养。体外各极性部位对肿瘤细胞增殖作用的测量采用SRB法。取处于对数生长期的HCT116、HepG2、MFC、Caco-2细胞制成细胞悬液，96孔板上每孔加入，培养24 h后加药处理。新疆阿魏石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇部位4组为药物组，用DMSO助溶后分别稀释成250、125、62.5、31.2、15.6 mg/L。每组设3个复孔，继续培养24 h。并设调零孔、对照组，三氯乙酸溶液（50%）固定细胞，冲洗5遍，每孔加入0.4%SRB染液，染色30 min后，再用1%乙酸漂洗4次，加150 μL Tris-base碱液（10 mmol/L，pH 10.5），反复振荡10 min，在酶标仪515 nm处测定吸光度值（A）[6]。计算肿瘤细胞增殖抑制率[（A对照孔－A给药孔）÷（A对照孔－A调零孔）×100%]。

根据各浓度抑制率，半数抑制浓度（IC50）采用Graphpad Prism 5软件的IC50计算模型计算。以上实验重复3次，求出3次实验各浓度的抑制率与IC50，以平均值作为最终结果。

2.3流式细胞术检测

取处于对数生长期的HCT116、HepG2、Caco-2细胞制成细胞悬液，每孔1 mL加入6孔板，培养24 h。设对照组与新疆阿魏石油醚部、乙酸乙酯部、正丁醇部、甲醇部4个给药组，药物浓度为62.5 mg/L，每孔加入2 mL含药培养基，培养24 h。取出6孔板，PBS打散成细胞混悬液，4 ℃、500 r/min离心5 min，重复清洗2次，加入染料Annexin V-FITC 5 μL混匀，4 ℃染色20 min，再加入PI染料10 μL混匀，4 ℃染色5 min。点样在96孔板中，流式细胞仪进行分析[7-8]。

3　统计学方法

4　结果

4.1新疆阿魏各极性部位一般情况

我们的地理课堂是地理学科知识分享的主阵地，所以学生应该成为分享的主体，更应该懂得如何去学，如何去内化，如何去完善，继而成为一种兴趣、一种习惯。地理教师用心“传递、授业、解惑”，他所主导的就是在这个过程中，让学生能够“知其所以然”。中学地理属于综合性学科，适当强调“学法”指导，更有利于确立学生的主体地位，让学生真正成为学习的主人。一句话“教师会教不如学生会学。”以下就近年来湘教版地理教材课堂教学实践方法方面，浅谈拙见。

新疆阿魏各极性分离部位所得产物的质量、比重、性状都不相同。通过阿魏成分特性推断，石油醚部富集了一些含硫的脂肪类成分及一些挥发性萜类；乙酸乙酯部、正丁醇部可能富含不同极性的香豆素倍半萜等；甲醇部则除香豆素倍半萜类外，含简单苯丙酸类衍生物类成分较多。正丁醇部、甲醇部得率低，石油醚部、乙酸乙酯部得率较高，有进一步开发利用的价值。结果见表1。

表1　新疆阿魏各极性分离部位的质量、得率、性状

4.2新疆阿魏各极性部位对肿瘤细胞增殖的影响

SRB法研究新疆阿魏各极性部位（250、125、62.5、31.2、15.6 mg/L）对HCT116、HepG2、MFC、Caco-2细胞的增殖抑制作用，结果表明，新疆阿魏各极性部位对HCT116、Caco-2、HepG2、MFC细胞的增殖均有一定抑制作用。其中石油醚部抑制作用较弱，在低浓度下还具有营养作用；新疆阿魏乙酸乙酯部位、正丁醇部位对肿瘤细胞的抑制效果比较明显，乙酸乙酯部位对Caco-2、HepG2、MFC细胞的IC50分别为14.8、28.7、9.0 mg/L，正丁醇部位对Caco-2、HepG2、MFC细胞的IC50分别为15.6、36.6、14.9 mg/L；新疆阿魏各极性部位对HCT116细胞增殖抑制较弱。表明新疆阿魏乙酸乙酯、正丁醇部位抗肿瘤活性较高，对Caco-2、HepG2、MFC细胞的抑制效果比较明显，为抗肿瘤活性部位，且在抗胃癌方面有进一步开发利用的价值。结果见表2～表5。

表2　不同浓度阿魏各极性部位HCT116细胞增殖抑制率比较（±s，%，n＝9）

表2　不同浓度阿魏各极性部位HCT116细胞增殖抑制率比较（±s，%，n＝9）

注：与对照组比较，*P＜0.05（下同）

浓度　　石油醚部　乙酸乙酯部　　正丁醇部　　甲醇部250/（mg/L） 92.2±1.4*　82.8±1.3*　81.3±7.9*　81.3±1.4*125/（mg/L） 69.4±5.5*　79.2±0.7*　72.9±5.5*　73.0±5.0*62.5/（mg/L） 37.3±2.5*　57.9±1.0*　45.2±4.5*　45.2±1.5*31.2/（mg/L） 21.7±0.4*　35.3±2.9*　34.9±0.8*　34.9±1.3*15.6/（mg/L） 12.3±0.1*　29.1±0.7*　19.9±1.2*　19.9±1.4*对照组　0　0　0　0 IC50/（mg/L）　68.7　43.7　60.3　59.6

表3　不同浓度阿魏各极性部位Caco-2细胞增殖抑制率比较（±s，%，n＝9）

表3　不同浓度阿魏各极性部位Caco-2细胞增殖抑制率比较（±s，%，n＝9）

浓度　　石油醚部　乙酸乙酯部　　正丁醇部　　甲醇部250/（mg/L）　31.2± 4.3*　88.5± 2.1*　79.2±3.5*　77.1± 1.4*125/（mg/L）　26.2± 2.1*　86.5± 1.5*　67.7±6.7*　72.1± 3.4*62.5/（mg/L）　22.1± 9.1*　84.7± 1.6*　67.3±9.4*　64.4± 0.6*31.2/（mg/L）　-0.5± 5.9*　76.0±41.4*　55.0±2.6*　51.3± 2.6*15.6/（mg/L） -47.7±13.1*　46.0± 3.3*　51.2±8.3*　39.6±11.2*对照组　0　0　0　0 IC50/（mg/L）　373.6　14.8　15.6　28.3

表4　不同浓度阿魏各极性部位HepG2细胞增殖抑制率比较（±s，%，n＝9）

表4　不同浓度阿魏各极性部位HepG2细胞增殖抑制率比较（±s，%，n＝9）

浓度　　石油醚部　乙酸乙酯部　正丁醇部　　甲醇部250/（mg/L）　1.3± 7.3*　81.0±1.6*　84.0±1.0*　82.0±2.8*125/（mg/L）-24.2±12.4*　73.2±1.4*　74.9±3.1*　79.8±2.5*62.5/（mg/L）-30.3±15.6*　63.2±4.5*　69.5±7.0*　59.2±4.1*31.2/（mg/L）-39.1± 7.6*　56.0±7.6*　49.6±3.3*　53.3±2.4*15.6/（mg/L）-27.2±12.7*　32.5±4.4*　22.7±7.1*　8.5±5.5*对照组　0　0　0　0 IC50/（mg/L）　　28.7　36.6　43.5

表5　不同浓度阿魏各极性部位MFC细胞增殖抑制率比较（±s，%，n＝9）

表5　不同浓度阿魏各极性部位MFC细胞增殖抑制率比较（±s，%，n＝9）

浓度　　石油醚部　乙酸乙酯部　正丁醇部　　甲醇部250/（mg/L）67.64±4.3*　93.65±5.8*93.98± 6.1*94.80±3.9*125/（mg/L）28.49±6.6*　93.14±5.3*92.09± 6.6*94.56±1.1*62.5/（mg/L）18.07±4.7*　89.82±1.1*88.79±11.1*88.89±0.7*31.2/（mg/L）14.40±4.6*　89.89±4.1*82.36± 8.9*70.39±1.4*15.6/（mg/L） 8.11±6.1*　64.08±1.5*49.19± 5.0*31.49±1.9*对照组　0　0　0　0 IC50/（mg/L）　179.2　9.0　14.9　21.8

4.3新疆阿魏各极性部位对肿瘤细胞凋亡率的影响

新疆阿魏分离的4个部位对HCT116、Caco-2、HepG2细胞均有不同程度的促凋亡作用，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。其中乙酸乙酯部促凋亡作用优于其他3个部位，HCT116、Caco-2细胞凋亡率差异有统计学意义（P＜0.05）。结果见表6、图1～图3。

表6　3种肿瘤细胞不同阿魏极性部位凋亡率比较（±s，%，n＝3）

表6　3种肿瘤细胞不同阿魏极性部位凋亡率比较（±s，%，n＝3）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与石油醚部比较，#P＜0.05；与乙酸乙酯部比较，△P＜0.05；与正丁醇部比较，▲P＜0.05

细胞　　对照组　　石油醚部　　乙酸乙酯部　　正丁醇部　　甲醇部HCT116　1.2±0.2△#▲　43.3±1.1△*　56.2± 0.9*#▲　46.4± 4.9△*　48.0± 5.5*Caco-2　1.8±0.9△#▲　12.3±3.4△*▲　64.0±10.4*#▲　80.0±11.5△*#　76.3±12.1△*#HepG2　2.1±0.7△#▲　9.1±3.7*△▲　80.8±11.6*#　73.4± 4.6*#　58.4± 4.1△*#▲

图1　新疆阿魏不同极性部位人结肠癌细胞HCT116凋亡流式细胞图

图2　新疆阿魏不同极性部位人结肠癌细胞Caco-2凋亡流式细胞图

图3　新疆阿魏不同极性部位人肝癌细胞HepG2凋亡流式细胞图

5　讨论

细胞水平上对抗肿瘤药物的筛选主要是采用MTT法、SRB法等。而在本研究中并未采用传统的MTT法，原因是MTT与新疆阿魏各极性部位反应，需要在药物处理结束后弃去含药培养液和PBS洗板，造成假阳性，而SRB法的操作步骤中染料不直接与含药培养基接触，且染色后不像MTT法易变色，细胞固定染色后在96孔板中可放置较长时间，因而受测定时间影响较小，为美国国立癌症研究所认证的药物对肿瘤细胞增殖抑制的检测方法，所以此法具权威性[9]。

通过不同极性溶剂将新疆阿魏分为石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇4个部位，并对各部位进行高效液相色谱检测，在梯度洗脱的色谱条件下，石油醚部没有色谱峰，推测石油醚部富集了一些含硫的脂肪类成分及一些挥发性萜类；乙酸乙酯部、正丁醇部、甲醇部有12个共有色谱峰，经与对照品色谱图、光谱图比对，含有阿魏酸、法尼斯淝醇A、法尼斯淝醇B、FarnesiferoneA、法尼斯淝醇C等，还有7个是未知峰，可能富含不同极性的香豆素倍半萜等，且各成分含量差异不大，这可能是乙酸乙酯部、正丁醇部、甲醇部药效相近的原因，由结果可知，新疆阿魏抗肿瘤的有效成分为香豆素倍半萜类。

为研究新疆阿魏不同分离部位的抑制肿瘤增殖作用的量效关系，本研究设置250、125、62.5、31.2、15.6 mg/L共5个浓度。研究表明新疆阿魏各极性部位在浓度范围内均对HCT116细胞的增殖有一定抑制作用，且抑制率随药物浓度加大而升高，表现为浓度依赖性。以IC50来评判，乙酸乙酯部位对HCT116细胞增殖抑制效果最好，为43.7 mg/L。

Caco-2细胞增殖抑制研究发现，新疆阿魏乙酸乙酯部位、正丁醇、甲醇部位在浓度范围内对Caco-2细胞的增殖有一定抑制作用，且抑制率随药物浓度加大而升高，也表现为浓度依赖性，石油醚部位在低浓度对肿瘤细胞起到营养作用，在高浓度则有一定抑制作用，其细胞的增殖抑制效果最好的是乙酸乙酯部位和正丁醇部位，其IC50分别为14.8、15.6 mg/L。

HepG2细胞增殖抑制研究发现，新疆阿魏乙酸乙酯部位、正丁醇、甲醇部位和Caco-2细胞的增殖抑制作用情况相似，但石油醚部位完全表现为营养作用。HepG2虽然是肿瘤细胞，但仍然保留大部分肝细胞的一些特性，能对石油醚部位里面脂肪族类化合物吸收利用。增殖抑制最好效果部位则是乙酸乙酯部位，IC50为28.7 mg/L。

MFC细胞增殖抑制研究发现，新疆阿魏各个极性部位对细胞的增殖均有明显抑制作用，抑制效果最好的是乙酸乙酯部位，IC50为9.0 mg/L。

采用流式细胞术检测新疆阿魏不同分离部位对结肠癌细胞HCT116、肝癌细胞HepG2、结肠癌细胞Caco-2的凋亡影响。结果表明，新疆阿魏各极性分离部位均对3种肿瘤细胞有一定的促凋亡作用，与对照组比较差异有统计学意义，促HCT116细胞凋亡作用以阿魏乙酸乙酯部位效果最好，促Caco-2细胞凋亡作用以正丁醇部、甲醇部效果最好，促HepG2细胞凋亡作用以乙酸乙酯部位、正丁醇部效果最好。

综上，新疆阿魏石油醚部位没有抗肿瘤活性，新疆阿魏乙酸乙酯部、正丁醇部对HCT116、Caco-2、HepG2、MFC细胞均有不同程度的增殖抑制和促进凋亡作用，甲醇部位活性较弱。其原因可能是倍半萜香豆素类、7-羟基香豆素的多种衍生物等能对肿瘤细胞有抑制作用的成分在此部位富集，与国外相关研究文献相符[3-5]。可以认为，乙酸乙酯、正丁醇部位是新疆阿魏抗肿瘤的有效部位。

笔者拟下一步进行抗肿瘤动物实验，研究乙酸乙酯、正丁醇部位的抗肿瘤药效，并对其药效物质基础和作用机理进行深入研究，为进一步开发新疆特色药材阿魏提供实验依据。

参考文献：

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（修回日期：2015-05-22；编辑：向宇雁）

Screening of Active Parts of Xinjiang Ferulae Resina with Anti-tumor Effects ZHANG Hai-ying1,2,
LI Wei2, ZHOU Long-long1, JIANG Lin2, ZHOU Ming-xin1(1. Xingjiang Medical University, Urumqi 830011, China; 2. Affiliated TCM Hospital of Xingjiang Medical University, Urumqi 830000, China)

Abstract:Objective To screen the active parts of Xinjiang Ferulae Resina with anti-tumor effects. Methods Solvent method was used to separate Xinjiang Ferulae Resina into parts with different polarities. SRB assay was applied to screen the effects of tumor cell inhibiting proliferation of different parts. Flow cytometry method was applied to study the effects of inducing tumor cell apoptosis of different parts. Results Petroleum ether parts of Xinjiang Ferulae Resina have no anti-tumor activity. Ethyl acetate and n-butyl alcohol polarity parts can inhibit proliferation and promote apoptosis of HCT116, Caco-2, HepG2 and MFC cells to some extent. Methanol polarity parts have weak anti-tumor effects. Conclusion Ethyl acetate and n-butyl alcohol polarity parts of Xinjiang Ferulae Resina have strong anti-tumor effects, which can be identified as active parts of Xinjiang Ferulae Resina with anti-tumor effects.

Key words:Xinjiang Ferulae Resina; anti-tumor; active part; apoptosis

收稿日期：（2015-04-07）

通讯作者：周铭心，E-mail：zmx9998@vip.sina.com

基金项目：国家自然科学基金（81260625）

中图分类号：R285.5

文献标识码：A

文章编号：1005-5304(2016)02-0052-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.015