李曦婷，董　俏，李化生，刘宝山，王　超，尹荣兰，刘梦志，李　文，张梦南，尹荣焕*

(1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110866；2.吉林省畜牧兽医科学研究院，吉林长春 130062)



文献综述

副猪嗜血杆菌检测技术及耐药性研究进展

李曦婷1，董俏1，李化生1，刘宝山1，王超1，尹荣兰2，刘梦志1，李文1，张梦南1，尹荣焕1*

(1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110866；2.吉林省畜牧兽医科学研究院，吉林长春 130062)

近年来，由副猪嗜血杆菌感染猪引起的副猪嗜血杆菌病在全世界普遍发生，对养猪业危害严重，再加上治疗副猪嗜血杆菌病需要大量抗菌药物，所带来的费用及急性感染导致仔猪死亡给养猪产业带来巨大损失，使国内外学者围绕副猪嗜血杆菌的检测技术及耐药性等进行了广泛而深入的研究。研究人员通过对不同分型方法的不断探索，试图找到准确性、重复性、快速性、便行性最好的分型技术，以便更好的对副猪嗜血杆菌病进行防控。论文对副猪嗜血杆菌的检测、血清分型、基因分型、耐药性调查及耐药机制方面的研究进展进行了全面综述，为副猪嗜血杆菌病的相关研究和有效防控提供参考。

副猪嗜血杆菌；检测；血清型；基因型；耐药性

副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis, Hps)属于巴斯德菌科嗜血杆菌属，是猪格氏病(Glasser's disease)的病原菌，可以导致猪出现多发性纤维素性浆膜炎和多发性关节炎。该菌最早在1910年由德国科学家Glasser发现，直到1922年被Schermer和Ehrlich首次分离到病原菌。副猪嗜血杆菌对生长环境要求严苛，对环境的耐受力较弱，Biberstein和White研究发现，其生长只需要V(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD)因子,而不需要X(铁卟啉)因子，因而得名副猪嗜血杆菌。首次培养在体积分数为5%的CO2培养箱中，胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)上生长良好，培养18 h～24 h，可见表面光滑、边缘圆滑、针尖大小成露珠样的单个菌落。该菌为革兰阴性菌，呈现多形态，从单个的球杆菌，到细长以至丝状的细菌。它与金黄色葡萄球菌共同划线培养时有卫星现象[1]。

所有饲养猪的国家几乎都有副猪嗜血杆菌的存在，除了引起疾病外，还经常是猪上呼吸道的常在菌[2]。在病猪抵抗力低下或对环境耐受减弱时，可侵入机体各器官引起发病，这也是仔猪死亡的主要原因之一。随着Hps的感染愈发严重，人们开始从分子水平对其进行大量研究。从基因水平上研究血清型，通过对不同分型方法的不断探究，试图找到更好的分型技术。由于疫苗之间存在异源性，不能很好的控制Hps引起的疾病，因此临床上常用大量抗菌药物治疗，故而导致多重耐药性的产生。总之，副猪嗜血杆菌病严重影响畜牧业的发展，对它的流行病学及耐药性方面有必要做全面的了解。

1　副猪嗜血杆菌检测技术

1.1Hps检测技术

目前副猪嗜血杆菌的分子生物学检测技术是最常用的检测手段。Oliveira等根据副猪嗜血杆菌16 S rRNA序列设计了1对特异性引物，目的序列片段为822 bp左右。但通过大量试验发现，此引物对一些相似的细菌会出现假阳性的现象。而后Angen O等[3]设计了特异性更高的3条引物，2条上游引物，1条下游引物(HpsF1 5′-TATCGGGAGATGAAAGAC-3′；HpsF2 5′-GTAATGTCT AAGGACTAG-3′；HpsR 5′-CCTCGCGGCTTCGTC-3′) ，使得检测更高效、准确，解决了前者出现的假阳性问题。苗立中等[4]建立基于SYBR GreenⅠ快速检测Hps的实时荧光定量PCR方法，敏感性比常规PCR高100倍，可用于Hps感染的早期诊断、流行病学调查以及Hps的定量分析。车勇良等[5]研究建立了一种可以快速检测Hps的环介导等温扩增方法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，根据GenBank中Hps肽聚糖相关脂蛋白基因保守区域设计外引物，内引物及环引物，并在体系中加入SYBR GreenⅠ，优化该可视化检测体系， 并用建立的Hps可视化LAMP对8株临床分离株进行检测， 结果均为阳性，并且可对感染Hps的猪的体液进行检测，建立了一种敏感性强、 反应快速和特异性高的凭肉眼可以判定结果的可视化LAMP方法。由于检测的便行性，可能更适合于推广于临床。PCR等方法被不断改进，已经从一种定性的分析方法发展到定量测定。迄今为止，检测技术已有十几种之多，对副猪嗜血杆菌的检测技术也在不断改进，使相应感染诊断结果也更加准确、高效。

1.2Hps的血清分型

不同国家、不同地区Hps流行株，血清学上存在差异。一般都是通过琼脂扩散血清分型方法(KRG)，将Hps分为15个血清型，命名为1～15型，另有约20%分离株尚不能分型。2007年，在美国、德国、澳大利亚、加拿大、西班牙、丹麦和日本分离菌株血清4型、5型和13型最为常见。2015年，从巴西分离出的菌株以4型、5型、13型和14型为主，另有39%的菌株不能分型；2014年，对江西分离到的47株Hps进行血清学检测，发现主要血清型为4型和5型，其次是13和14型，另有3株不能确定血清型；对东北地区分离的Hps进行血清型鉴定结果显示，主要血清型为5型和13型，其次为1型、4型和12型；对华南地区分离到Hps的进行血清分型，主要血清型为 5型和4型，不可分型菌株占20%[6-7]。由大量数据可看出，目前国内外的流行株均以4型、5型和13型为主，并且近10年来主要流行的血清型未发生变化[8]。现有研究表明，可用PCR鉴定血清型，除了5型和12型由于鉴别时使用的是同一对引物而不能确定外，其余血清型均可100%确定。这在一定程度上又提高了血清型检测的准确性和高效性，使Hps血清型的研究提升到了基因水平上[9]。不同血清型之间致病力存在较大差异，其中1、5、10、12、13、14型毒力很强，2、4、15型为中等毒力株，其他血清型毒力较弱，可认为是无毒力株[10-11]。虽然血清型与毒力存在一定关系，但是相对的，因为同一血清型，毒力也不尽相同。同样，各个血清型之间、同一血清型之间的交叉保护力也存在差异。因此，从疫苗的角度来讲，不能够很好的预防此病。

1.3Hps基因分型技术

大量研究显示，血清型不能对Hps进行完全的分型。研究者们想通过在分子水平上对基因做系统的研究，将Hps进行完全的鉴定分型。目前可用到的基因分型包括肠杆菌基因间重复序列PCR(ERIC-PCR)、多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)、脉冲场凝胶电泳(pulsed field gelelectrophoresis,PFGE)、单基因座序列分型等。

应用ERIC-PCR指纹图谱对Hps进行分型，发现47株Hps产生28种不同的指纹图谱。其中包括分离自同一猪场的相同血清型的菌株表现出不同的指纹图谱，还包括无法进行血清分型的Hps应用该方法也可得到充分区分。Macedo N R等[12]应用 ERIC-PCR 指纹图谱对巴西猪场中分离的Hps进行鉴定，63株Hps共发现了33种基因型。ERIC-PCR方法虽然可以将Hps进行多样的分型，但是存在一定缺点，各个研究组之间基因型难以比较。而MLST分型法虽然需要进行全基因测序，成本昂贵，但其分辨率高，并且比ERIC-PCR 技术基因分型更易比较。它是基于核酸序列测定的细菌分型方法，通过PCR扩增多个管家基因内部片段，测定其序列，分析菌株的变异，从而进行分型。Mullins M A等[13]应用MLST 分型方法，对127个菌株进行研究，7个管家基因(mdh、6pgd、 atpD、 g3pd、 frdB、 infB和rpoB基因)序列中确定了278个变异位点，重新定义了116个独特的序列类型。贾爱卿等[14]应用MLST方法表明，分离的Hps中7个管家基因均存在不同程度变异，平均变异率为52.4%。

随着研究的不断深入和技术的不断更新，基因的不断进化变异，可将Hps的分型更加细化。还可以通过大量试验，系统化的研究表达同一段蛋白的基因，可以帮助找到规律性差异，为更好的分型提供参考。Howell K J等[15]对Hps编码荚膜多糖序列分析，15种血清型中除了5型和12型没有一个独特的区域，其余血清型都具有一个独特的区域，该区域可进行后续的Hps分型研究。

2　副猪嗜血杆菌的耐药性

2.1耐药性起源及机制

研究发现，抗生素存在于人类和动物生存环境中，包括人类的饮用水中，它们数量庞大，种类不尽相同[16]。抗生素的无处不在使耐药性问题更加突出。目前认为耐药性可分为固有耐药性(intrinsic resistance)和获得耐药性(acquired resistance)两大类。固有耐药性即本身或突变产生的耐药基因；而获得耐药性，是由于细菌与抗菌药物发生反应后，本身的代谢途径发生改变，不易被抗菌药物抑制或杀灭，并且可以由质粒介导耐药性[17]。可大致将产生耐药性的机制分为以下几点：细胞膜通透性发生改变，产生酶类破坏抗菌药物活性，抗菌药物在体内发生变化，作用靶位改变，外排泵发生改变[18-22]。同时还会出现交叉耐药性，主要是由于相似结构的抗菌药之间耐药性的传递。多重耐药性也会出现，指的是不同的耐药基因位于同一个可移动的转座子或质粒上，因此同一细菌可耐多种抗菌药。

2.2Hps耐药性调查

作为对养猪业危害严重的病原菌之一，副猪嗜血杆菌的耐药性同样很受重视。2004 年，丹麦学者发现Hps中存在对三甲氧苄氨嘧啶和磺胺甲恶唑多重耐药的现象。随后外国学者分别调查在英国和西班牙分离到的Hps的耐药性，发现英国分离的Hps对新霉素仅存在20%的耐药菌，而西班牙分离的Hps存在多药物耐药现象，其中包括土霉素、红霉素、替米考星、青霉素、氨苄青霉素、硫姆林、三甲氧苄氨嘧啶和磺胺甲恶唑。由此可见，同一时期、不同地区的耐药性有很大差别。2010年，Zhou X等[23]研究发现，在中国分离到的Hps不仅对红霉素、替米考星、青霉素、氨苄青霉素、三甲氧苄氨嘧啶和磺胺甲恶唑耐药，还增加了对恩诺沙星、四环素、庆大霉素、大观霉素、环丙沙星、左氧氟沙星和泰妙菌素耐药现象。2011年，Xu C等[24]发现存在少量Hps对头孢噻肟和头孢他啶的耐药。由于头孢噻肟和头孢他啶具有广谱、高效的特点，在临床上大量使用，因此会产生不同程度的耐药现象，此类药物一旦产生耐药现象，同类药物使用都会耐药。由此可见，不同地区首选使用的抗菌药物不同，产生的耐药现象也不尽相同。2013年—2014年，张悦等[25]研究发现，Hps药敏试验结果为所有菌株都对阿奇霉素、替米考星、泰妙菌素、阿米卡星、头孢噻呋和左氧氟沙星敏感,超过90%的菌株对红霉素、氟苯尼考、壮观霉素、青霉素、氨苄青霉素和环丙沙星敏感,但对四环素和恩诺沙星耐药率较高。耐药谱分析显示,37.1%的菌株对两种以上的抗菌药耐受。Dayao D A E等[26]研究发现，澳大利亚的菌株表现出最低抑菌浓度升高的现象，分别为氨苄青霉素(1%)、青霉素(2%)、红霉素(7%)、替米考星(14%)、泰拉霉素(22%)、四环素(31%)、复方磺胺甲恶唑(40%)。2015年有研究发现，中国分离到的3株Hps对头孢类、黏杆菌素类高度敏感，对四环素类、喹诺酮类和青霉素类药品明显耐药。同年米丁丹等[27]研究发现，30株HPS对氨苄西林、泰妙菌素、恩诺沙星和亚胺培南的耐药率较高，分别为50%、50%、46.7%和100%。这些研究证明，各个地区分离菌株药敏试验结果不一致，不同时间段菌株的耐药性也存在差异，应对特定地区其耐药性进行长期监测。

2.3Hps耐药机制

副猪嗜血杆菌的耐药性问题正在困扰着养猪业，因此对于Hps耐药性机理的研究也成为热点。试验证实突变的位点是产生耐药性的原因之一。2011年，Chen P等[28]发现，Hps中存在对喹诺酮抗性决定区域DNA旋转酶(GyrA和GyrB)和拓扑异构酶Ⅳ的突变位点。在GyrA基因密码子83或87中至少有1个突变位点，GyrB基因密码子在73或77处也存在突变位点。后续有研究发现，GyrA87位点在所有耐受恩诺沙星菌株中的突变率为100%，这就提示了GyrA87位点的突变对Hps喹诺酮耐药性形成有重要的影响。同时研究还发现ParC73位点的突变，能够协助其他相关突变位点增强Hps对喹诺酮药物的耐受性。2010年，Chen L P等[29]在分离到的Hps中分离到质粒Phn-61，可编码Lin(c)耐药基因，属于林可胺类耐药基因。2012年，在国内分离到的Hps中还分离到耐药质粒Phps-A67，可编码耐药基因SulⅡ和StrA，分别属于磺胺类耐药基因和链霉素类耐药基因[30]。acrA基因在细菌多重耐药中起重要作用，徐丽娜等[31]试验首次发现副猪嗜血杆菌会存在2个acrA基因。这些研究不仅为副猪嗜血杆菌多重耐药机制的研究提供了理论基础，同时还对新型抗菌药物的研发也具有重要的参考价值。2015年外国学者从健康断奶仔猪体内分离出的Hps含有新型blaROB-1质粒可抗β-内酰胺类药物，命名为pJMA-1，试验还证实此耐药基因可转移到机体其他细菌中[32]。减少耐药性可通过对耐药基因敲除等办法将耐药基因破坏。通过对耐药机制的不断深入研究，可以避免或消除耐药性的产生。但新药开发及机理的研究是一个漫长的过程，因此应在不断探寻机理的基础上合理应用抗菌药物必要时联合用药。

3　小结与展望

近年来，世界各地猪场发生多发性浆膜炎和关节炎的报道屡见不鲜，其中大部分病例被诊断为由副猪嗜血杆菌引起。由于Hps血清型众多，之间又无交叉免疫力，疫苗控制收效甚微，抗菌药物的使用就显得尤为重要。对于血清型的确定及耐药性的研究也已成为时势所趋。并且随着猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒感染不断增多，使猪的免疫力、环境耐受力急剧下降，混合感染现象十分常见，而Hps常作为继发、并发感染不断危害着养猪行业[33]。为了防控Hps病的大面积暴发，需要改善猪群饲养管理及环境卫生，发病后及时诊断并合理有效的应用抗菌药物，以达到预防和治疗的效果。

目前，通过对Hps基因分型、耐药性及耐药机制的不断深入研究，有助于快速、准确的找出毒力基因，以开发出具有针对性的新型不易产生耐药性的抗菌药物。

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2016-03-17

辽宁省教育厅优秀人才支持项目(LJQ2013070)；辽宁省自然科学基金项目(201602667)

李曦婷(1991-)，女，辽宁沈阳人，硕士研究生，主要从事兽医公共卫生学研究。*通讯作者

S852.612

A

1007-5038(2016)10-0085-05