兰炎根，陈舒华，陈凯，田道法，何迎春，黄冬云

(1.梅州市人民医院耳鼻咽喉一科，广东 梅州 514000；2.佛山市第二人民医院耳鼻咽喉科，广东 佛山 528000；3.湖南中医药大学，湖南 长沙 410008)

鼻咽癌高癌家系外周单个核细胞蛋白质组学研究

兰炎根1，陈舒华2，陈凯1，田道法3，何迎春3，黄冬云1

(1.梅州市人民医院耳鼻咽喉一科，广东 梅州 514000；2.佛山市第二人民医院耳鼻咽喉科，广东 佛山 528000；3.湖南中医药大学，湖南 长沙 410008)

目的 寻找鼻咽癌高癌家系鼻咽癌的癌变机制、早期诊断、治疗和预后监测的外周血特异性分子标志物。方法 利用双向凝胶电泳技术(2-DE)分别分离鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者、鼻咽癌高癌家系成员及健康对照组外周血单个核细胞的总蛋白，经蓝银染色后进行图像分析，并对差异表达的蛋白质点进行识别，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱得到肽质量指纹图谱，搜索数据库鉴定部分差异蛋白质点。结果 建立了鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者、鼻咽癌高癌家系成员及健康对照组外周血单个核细胞的2-DE图谱；发现并鉴定了鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者、鼻咽癌高癌家系成员及健康对照组之间的差异表达大于2倍的蛋白质点19个，这些差异蛋白质点主要为蛋白质合成与分解、抗氧化应激、分子伴侣、细胞结构相关蛋白质、三大代谢相关酶类以及信号传导相关蛋白质等。结论 通过对鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者、鼻咽癌高癌家系成员及健康对照组外周血单个核细胞的比较蛋白质学研究，筛选并鉴定到19个与鼻咽癌高癌家系鼻咽癌发生相关的蛋白质，其中HSP27、Protein S100-A9、Prohibitin可能成为鼻咽癌高癌家系鼻咽癌癌变机制、早期诊断、治疗及预后监测的外周血特异性分子标志物。

鼻咽癌；高癌家系；外周血单个核细胞；蛋白质组学

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一种主要来源自鼻咽黏膜上皮细胞癌变的恶性肿瘤，据研究统计其致死率约占全部恶性肿瘤致死率的2.81%，在我国的癌症致死疾病中排名第八，在头颈恶性肿瘤中一直是首要致死肿瘤。研究表明，鼻咽癌病例的80%以上发生在我国，是国内重点防治的十大恶性肿瘤之一。鼻咽癌发病率多发生于我国南方地区，以广东省最高，其次依次是广西、湖南、福建、江西等省区。鼻咽癌的男性发病率超过0.03%，在女性达到0.015%以上。通常情况下鼻咽癌可发生于各年龄阶段，年龄跨度3～90岁，但30～50岁为鼻咽癌发病高峰年龄段，另外有研究表明鼻咽癌发病还表现出明显的家族聚集现象[1-2]，且这种聚集性在不同人种中均有发生。分析已发表的文献可知鼻咽癌高癌家系中的鼻咽癌大概占总鼻咽癌发病数的7.7%。鼻咽癌患者的一级亲属是患鼻咽癌的高危人群，源于鼻咽癌患者的高家族聚集性[3]。调查研究显示：约10%的鼻咽癌患者具有癌家族史，其中约有50%具有鼻咽癌家族史，而大部分患者集中在一级亲属。因此，鼻咽癌高癌家系中鼻咽癌患者的早发现和诊断对其治疗和预后具有极其重要的意义。

在本研究中，我们应用分离纯化的方法提取鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者和鼻咽癌高癌家系成员外周血淋巴细胞的蛋白，并以健康人作为对照，经双向凝胶电泳(2-DE)双得到分辨率和重复性较高的图谱，利用PDQuest软件比较分析图谱中差异表达量两倍以上的蛋白点，并用MALDI-TOF-MS质谱仪进行蛋白分析，鉴定相关的蛋白质，为研究鼻咽癌高癌家系肿瘤发生机制奠定基础，同时也为临床对鼻咽癌高癌家系高危人群鼻咽癌的早期发现、早期诊断以及寻找药物治疗耙标提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 鼻咽癌高癌家系选定标准在先证鼻咽癌患者的一级亲属中(包括父母，同胞兄弟姊妹，子女)，有2人以上(含2人)经病理活检确诊为鼻咽癌的家系。以26例2008-2009年在佛山市第二人民医院耳鼻喉科门诊确诊为鼻咽癌的病例为研究对象。研究分为三组，第一组为鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者，共计11个家系，11人，其中男性9人，女性2人，平均年龄(46.47±12.85)岁；第二组为鼻咽癌高癌家系核心成员(包括父母、子女及同胞)，共计15人，其中女性7人，男性8人，平均年龄(44.45±13.49)岁；第三组为正常人组，共计15人，其中男性9人，女性6人，平均年龄(50.74±11.03)岁。

1.2 试剂 Amersham Biosciences公司产品：Sample Grinding Kit组织研磨试剂盒、2D Quant Kit蛋白定量试剂盒、Triton X-100、NP-40、尿素、二硫苏糖醇(DTT)、硫脲、IPG缓冲液(pH3-10NL)、两性电解质(pharmalyte，pH3-10)、覆盖液、碘乙酰胺、固相pH梯度干胶条(IPG strip pH3-10NL，24 cm)、双向凝胶电泳标准蛋白质均；Sigma-Aldrich公司产品：丙烯酰胺、硫代硫酸钠、碳酸氢铵、CHAPS、SDS、甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲-酮-胰蛋白酶(TPCK-Trypsin)、基质а-氰基-4-羟基肉桂酸、甘氨酸、Tris、三氟乙酸、铁氰化钾、甲叉双丙烯酰胺；碳酸钠、硝酸银、甘油、甲醛、EDTA二钠、戊二醛、乙醇和乙酸均为国产分析纯级别。

1.3 仪器 Applied Biosystem公司的 MALDI-TOF-MS质谱仪(Voyager-DE STR 4307)；PDQuest 7.0凝胶图像分析软件(Bio-Rad公司)；Imagescanner扫描仪、IPGphor等电聚焦仪、Ettan DALT垂直电泳槽均为Amersham Biosciences公司产品。

1.4 方法

1.4.1 外周血单个核细胞的分离 在无菌条件下采集静脉血10 mL，加入含有肝素的无菌抗凝管中，立即轻轻摇匀样品。加入等体积无菌D-Hank's液(NaCl 8.0 g，NaH2PO4·12H2O 0.134 g，KH2PO40.06 g，KCl 0.4 g，NaHCO30.35 g，溶于1 000 mL超纯水)。抽取淋巴细胞分层液8 ml加入离心管(50 mL)中，沿管壁慢速加人稀释血液，保持分离界面稳定，使两种样品不相混，在20℃2 000 r/min条件下离心30 min，吸取淋巴细胞层加人50 mL离心管中，用5倍体积的D-Hank's液洗涤两次，室温条件下依次在2 000 r/min和1 500 r/min离心10 min，将混杂的血小板去除，将10 mL超纯水混合细胞团块1 min后迅速加入等体积的1.8%NaCl溶液，2 000 r/min离心后弃上清，-80°C保存备用。

1.4.2 抽提细胞总蛋白 使用组织裂解液提取鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者、鼻咽癌高癌家系亲属及正常人外周血淋巴细胞中的总蛋白质，组织裂解液含：7 mol/L尿素、二硫苏糖醇、5 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)，2 mol/L硫脲、2%NP-40、100 mmol/L DTT、4%CHAPS、1%Triton X-100、40 mmol/L Tris、2% Pharmalyte、0.5 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)。涡旋充分混匀后置于冰上孵育1 h后12 000 r/min，4℃条件下离心1 h，吸取上清移入新EP管中。吸取5 μL上清，使用2D Quant Kit定量试剂盒测定蛋白的浓度。

1.4.3 双向凝胶电泳和质谱分析 主要参照文献[4]的方法。

1.4.4 图像分析 使用Imagescanner扫描仪进行扫描；通过点检测、匹配、量化比较获取斑点的相关信息，分析使用PDQuest图像分析软件进行。所有统计数据的分析均由Excel 2000软件完成。

1.4.5 数据库查询 使用软件Mascot Distiller对肽质量指纹图谱(PMF)进行单同位素峰识别，将所获得的肽端的质荷比(m/z)数值输入Mascot质谱搜索软件(Matrixscience)进行分析，从数据库为物种来源为人类的SWISS-PROT的Uniprot和NCBI非冗余蛋白质数据库进行搜索，条件：最大允许肽段质量误差100 ppm，选择[M+H]+离子种类和单同位素峰，选择半胱氨酸碘乙酰胺化为固定修饰，最大允许的漏切的胰酶酶切位点数为1。

2 结果

2.1 双向凝胶电泳图谱及差异蛋白质点 双向凝胶电泳将外周血单个核细胞总蛋白质进行了分离，考马斯亮蓝染色后得到分辨率高、重复性好、背景清晰的鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者、鼻咽癌高癌家系成员及正常人组2-D凝胶图谱各3块。PDQuest图像分析显示：9块胶的平均点数为(1 224±45)，各组之间拥有(92±1.6)%的平均匹配率。计算统计三块胶后得到组内的双向电泳凝胶的平均胶(即组内凝胶上的同一蛋白质点的平均表达量)，某个蛋白质点的表达量按照公式：胶上的灰度体积=面积×灰度进行统计，最终得到鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者、鼻咽癌高癌家系成员及正常人组外周血单个核细胞表达变化差异大于两倍的蛋白质点共22个(图1)。各组人外周血单个核细胞双向凝胶电泳图谱及差异蛋白质点，400 μg总蛋白质经第一相pH3-10NL等电聚焦和二相10% SDS-PAGE分离后，经考马斯亮蓝染色和后续扫描后，PDQuest软件分析显示每块胶平均点数为1 245个。

2.2 差异蛋白质点的MALDI-TOF-MS质谱鉴定及数据库查询 经MALDI-TOF-MS质谱仪分析后差异蛋白质点得到PMF图谱后，使用Mascot质谱搜索引擎搜索SWISSPROT的Uniprot数据库，鉴定得到19个蛋白质。5号蛋白质点的PMF图谱和SWISSPROT数据库中的搜索结果分别见图2和图3，19个得到鉴定的差异表达蛋白质的名称和表达量变化的倍数见表1和表2。

图1 三组研究对象2-DE图注：a，高癌家系癌患者组2-DE图；b，高癌家系癌患者成员组2-DE图；c，健康家系对照组2-DE图。

图2 质谱分析所得第5号蛋白质点的PMF图谱注：峰旁标示数字表明了肽段的单同位素峰[M+H]+的质量数。

图3 第5号差异点在SWISSPROT的Uniprot数据库中的搜索结果注：质谱分析得到蛋白质点5的PMF经Mascot质谱搜索引擎搜索蛋白数据库得到蛋白质的得分情况(98分)，鉴定为Protein S100-A9。

表1 鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者组对正常人组差异蛋白质点的鉴定

表2 鼻咽癌高癌家系成员组对正常人组差异蛋白质点的鉴定

3 讨论

本研究中使用患者的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)作为研究样本，这就使得不同患者间出现个别差异性蛋白，患者的双向电泳凝胶图像重复性不太好。同时受限于临床标本采血量的限制，单例患者分离得到的单个核细胞数量大约为10×106个，总蛋白为200～400µg。本研究实验成本较高，为充分分析研究样本，又使得研究结果具有良好的代表性，采取了将一部分3～5人提取总蛋白混合后再上样进行双向电泳凝胶的方法，这样在有效保证了在高分辨率的情况下使得双向凝胶电泳的又具有良好的可重复性高，也使具有意义的差异表达蛋白质能更明显地呈现出来。混合外周血单个核细胞研究的优点在于，不仅在同样研究条件情况下尽可能多增加样本分析数量，这就能消除一些非特异性干扰，使有意义的蛋白质在多样本的情况下表达情况得到更好的保证，使研究结果更加能够代表总体真实情况。另外对于利用蛋白质组学技术对疾病蛋白标志物或耐药蛋白质进行筛选，这种多样品混合的方式也是一个比较经济可行的方案，但是个体情况不能很好地反映出来。本研究获得了鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者和成员，以及正常家系成员的PBMC蛋白质表达谱情况，重复性较好。外周血单个核细胞凝胶的平均蛋白质点数分别为(1 224±45)、(1 249±43)和(1 180±4)，分别对应92.8%、91.9%和91.6%的组内平均匹配率。双向电泳凝胶进行显色采用改进的考染方法，其灵敏度优于传统的考染方法，源于胶本身着色较浅，背景去除较干净。改进的考马斯亮蓝法染色与传统的染色方法相比，优势明显，其灵敏度达到Ing/蛋白点。使用PDQuest软件对差异表达点进行分析后，随机选取22个差异点进行质谱的质量指纹图测定，19个蛋白得到鉴定，表达明显增强有10个，明显下降的有9个，这些差异蛋白质点主要为蛋白质合成与分解、代谢相关酶类、信号传导、抗氧化应激反应、细胞结构相关蛋白质和分子伴侣相关蛋白质六类，经进一步分析19个蛋白中的HSP27、Protein S100-A9、Prohibitin可能成为鼻咽癌高血特异性标志物。

分子伴侣(molecular chaperones)是进化上非常保守的蛋白质，广泛分布于各种生物体内，能够结合和稳定其他蛋白质的不稳定构象，参与细胞器中蛋白质的跨膜运输。热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是一大类分子伴侣，共分为五类，分别为HSP110，HSP90，HSP70，HSP60以及小分子热休克蛋白(small heat shock proteins，sHSPs)。热休克蛋白主要是细胞在应激原特别是环境高温诱导下所生成的一组蛋白质，对维持细胞的存活必不可少。本研究中发现的HSP27属于sHSPs亚家族，参与调控细胞的增殖、分化和凋亡及信号转导，因此可能与多种肿瘤的产生相关。研究发现HSP在鼻咽癌中上调表达并与鼻咽癌发生危险度有一定程度的相关性[5]。HSP27蛋白在鼻咽癌中的作用机理有多种可能性：一种可能是作为应激蛋白对肿瘤病理性刺激的一种自我保护性反应，在肿瘤发生的个体中反应性地发生作用。另外一种可能性是与细胞凋亡密切相关。本研究中鉴定出HSP27和HSC70两个热休克蛋白，在鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者的PBMC中HSP27及HSC70的表达量上调明显，相对健康人组的表达水平，HSP27在鼻咽癌高癌家系成员组中也上调明显，与Hela细胞中发生的情况相同[6]。从相关研究可见，HSP27不仅可以参与蛋白质的折叠组装和运输，也可能与肿瘤的发生和发展密切相关，其功能十分多样化[7-9]。HSP27能使谷胱甘肽水平增加，对细胞的自我解毒也有作用[10]，对肾脏上皮细胞粘附和增殖具有促进作用，从而抑制其凋亡[11]。本研究发现在鼻咽癌高癌家系中鼻咽癌高癌家系成员及鼻咽癌患者HSP27表达逐渐明显增强，推测HSP27可能对癌细胞的增殖有促进作用，与细胞的解毒、修复及抑制凋亡可能也有关联，还需要后续的研究证明其具体的功能。

抗增殖蛋白基因(prohibitin，Phb)是一种潜在的抑癌基因，能在细胞增殖、分化与凋亡过程中发挥重要作用[12]。抗增殖蛋白基因定位于17q21，与卵巢癌和乳腺癌易感基因(BRAC1)转座子相邻[13]，主要通过阻断DNA合成而对细胞增生起负性调节作用[14]。抗增殖蛋白在细菌、植物、酵母、原虫及哺乳类等生物细胞中都有存在。抗增殖蛋白的氨基酸结构十分保守，属于新型的分子伴侣蛋白，还具有转录调控作用。本研究在鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者组和成员组中均检测出抗增殖蛋白，同时发现其表达量逐渐增强。巧合的是在已有的研究报道中也发现抗增殖蛋白在肝细胞癌[15]、乳腺癌[16]和胃癌[17]的细胞系中亦同样有高表达，这就表明抗增殖蛋白属于抑癌蛋白，在于肿瘤组织及肿瘤细胞系中广泛存在。推测在鼻咽癌高癌家系中抗增殖蛋白基因可能发生了基因突变或者蛋白质合成，使之不能行使正常的功能。它在肿瘤发生发展过程中出现早，这就证明抗增殖蛋白很有可能作为鼻咽癌高癌家系鼻咽癌早期诊断的标记物,但是需要更进一步的更大样本的试验检验和验证。

钙结合蛋白S100A9是一个含有114个氨基酸残基分子量约为13 000的蛋白，其钙离子的结合位点由两个EF手型基序结构组成。钙结合蛋白S100A9是将细胞内钙离子浓度改变作为中介信号，从而转换其激动或抑制作用。已有的研究报道表明S100A8和S100A9在肌细胞粘附、收缩、增殖分化及癌细胞转移中可能发挥重要作用，有关钙结合蛋白与癌症的研究也主要集中于食道癌、膀胱癌、前列腺癌和胃癌的研究中[18-20]。本研究鉴定出的差异蛋白S100A9在鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者和鼻咽癌高癌家系成员组中表达量逐渐增强，且鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者组的表达量明显高于鼻咽癌家系成员组，提示S100A9蛋白可能在鼻咽癌高癌家系鼻咽癌发生过程中起重要作用。

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Study on proteome of human peripheral blood mononuclear cells in familial nasopharyngeal carcinoma.

LAN Yan-gen1,CHEN Shu-hua2,CHEN Kai1,TIAN Dao-fa3,HE Ying-chun3,HUANG Dong-yun1.1.Department of Otolaryngology,Meizhou People's Hospital,Meizhou 514000,Guangdong,CHINA;2.Department of Otolaryngology,the Second People's Hospital of Foshan,Foshan 528000,Guangdong,CHINA;3.Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410008,Hunan,CHINA

Objective To look for reliable peripheral blood biomarkers for early diagnosis,treatment,mechanism of cancerization and evaluation of nasopharyngeal carcinoma(NPC)from familial nasopharyngeal carcinoma. Methods The proteins of peripheral blood mononuclear cells(PBMC)in nasopharyngeal carcinoma(NPC)from familial nasopharyngeal carcinoma,health members of familial nasopharyngeal carcinoma or healthy adults groups were separated by two-dimensional gel electrophoresis(2DGE),respectively.Then gels were stained by blue silver,scanned by ImageScanner and analyzed with PDQuest software.Relative abundance of the protein spots between familial nasopharyngeal carcinoma and health members of familial nasopharyngeal carcinoma groups,and between health members of familial nasopharyngeal carcinoma or healthy adults groups were calculated by comparing spots density volume on the gel. The differentially expressed protein spots were identified by peptide mass fingerprint(PMF)based on matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF-MS)and database searching.Results Well-resolved and reproducible 2DGE maps of PBMC from patients with NPC from familial nasopharyngal carcinoma,health members of familial nasopharyngeal carcinoma or healthy adults were acquired.Nineteen more than 2 folds differentially expressed protein spots were identified.Some of these proteins participated protein synthesis and degradation,or chaperone,or protection and detoxification,or cytoskeleton,while some of those were involved in metabolism or signal transduction.Conclusion Through comparative proteomic analysis of PBMC in patients with NPC from familial nasopharyngal carcinoma,health members of familial nasopharyngeal carcinoma or healthy adults,19 aging related colonic epithelial proteins were identified.HSP27,Protein S100-A9,Prohibitin may become reliable peripheral blood biomarkers for early diagnosis,treatment,mechanism of cancerization and evaluation of NPC from familial nasopharyngeal carcinoma prognosis.

Nasopharyngeal carcinoma(NPC);Familial;Peripheral blood mononuclear cells;Proteomics

R739.63

A

1003—6350（2016）15—2419—06

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.15.004

2016-03-17)

国家自然科学基金（编号：30572408）

兰炎根。E-mail：775333764@qq.com