高娜

·实验研究·

早期糖尿病大鼠视网膜Notch-1表达变化的初步研究

高娜

目的 研究发现Notch受体与其Delta样配体4的信号通路参与糖尿病视网膜病变病程进展,但其信号通路在糖尿病视网膜具体作用并未得到具体研究。故本次研究SD大鼠糖尿病模型早期视网膜内Notch-1表达变化。方法 2月龄雄性SD大鼠40只,随机分为4组(对照1月组,对照2月组,糖尿病1月组,糖尿病2月组),糖尿病(diabetes mellitus,DM)模型组均予以60mg/Kg体重链脲佐菌素(STZ,streptozocin)腹腔注射,造模成功后对比模型组和对照1月以及2月组视网膜内Notch-1 受体表达变化。结果 免疫组化结果显示Notch-1在大鼠视网膜神经节细胞层分布最为集中,且比正常对照组表达明显增强。免疫印迹结果显示DM 1月和2月组Notch-1蛋白表达均明显高于对应正常对照组,但DM 1月和2 月组间未见显著差异。结论 早期糖尿病大鼠视网膜神经节细胞层Notch-1表达明显增强,其在糖尿病视网膜病变可能有着重要的干预作用。

糖尿病； 糖尿病视网膜病变； Notch-1

目前,Delta-Notch信号通路被认为是调节新生血管发生的另一个重要机制,VEGF和Delta-Notch信号通路在多方面相互作用[1],在肿瘤血管的研究中发现联合抑制VEGF和Delta-Notch号通路可协同抑制肿瘤生长[2]。DII4/Notch信号通路有望成为针对新生血管的又一新靶点,而新生血管作为糖尿病视网膜病变最严重的并发症,此信号通路的研究将为糖尿病视网膜病变的治疗提供新方向。所以本次实验初步研究早期糖尿病SD大鼠模型Notch-1信号通路改变,为临床治疗提供理论依据。

1 实验材料及方法

1.1 实验材料

清洁级2月龄雄性SD大鼠40只(成都中医药大学实验动物中心提供),体重200～250克。实验动物均适应性喂养一周,予以自由饮食和饮水,室内温度为24±3°C,相对湿度为50±15%,其余按照实验室饲养标准进行。实验材料及设备主要包括：STZ,十二烷基磺酸钠、过硫酸铵、四甲基二乙胺、甘氨酸、Tris-base(美国Sigma)；柠檬酸缓冲液,免疫组化试剂盒 (武汉博士德),血糖仪及试纸(美国强生)；HRP标记二抗羊抗兔,Notch 兔抗大鼠抗体(美国Santa Cruz ),ECL发光液 (Thermo scientific)；RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS上样缓冲液液体(5X)(北京碧云天)；电泳仪电源,垂直电泳仪,垂直转膜仪(美国bio-rad)；高速低温离心机 (Thermo scientific)。

1.2 实验方法

SD大鼠(200～250g)禁食12h,腹腔注射60 mg STZ后(对照组注射生理盐水),自由饮食,72小时后再次测空腹血糖,血糖浓度超过13.8mmol/L认为造模成功,自由饮食1月,每周剪尾测空腹血糖一次,剔除血糖低于13.8mol/L大鼠。1月组和2月组均在相应时间予以3%戊巴比妥钠 30mg/Kg麻醉,摘除一侧眼球后显微镜下取出视网膜至于液氮中,随后右心灌注PBS后继续灌注4%多聚甲醛,取眼球后4%多聚甲醛进行固定,后期行视网膜切片。视网膜切片石蜡包埋后视神经标识切片,厚度为5μm,贴片脱蜡复水后柠檬酸缓冲液抗原修复,Notch-1 兔抗大鼠抗体(1:50) 4℃孵育过夜,PBS冲洗后羊抗兔1:500室温孵育1h,DAB显色,镜下观察拍照。视网膜免疫印迹主要步骤为视网膜组织裂解匀浆,BCA法检测蛋白含量,按比例加入SDS-PAGE上样缓冲液,95℃充分变性后-20℃保存。7.5%分离胶,5%浓缩胶,每孔上20微升细胞裂解上样液,边孔加入5微升预染Marker,80V电泳,100mA低温转膜。转膜后5%脱脂奶粉室温封闭1h,Notch-1 兔抗大鼠抗体(1:500)室温下孵育2h,或者予以β-actin内参室温孵育2h,其后予以HRP标记二抗羊抗兔(1:3000)室温孵育1h,TBST再次洗膜,ECL发光,X光片中曝光。Gel-pro analyze 4.5凝胶分析系统检测目的条带及内参IOD值,每次分别测量3次后记录两者比值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23．0软件进行统计学分析,免疫印迹IOD平均值±S表示。组间比较采用独立样本t检验。

2 结果

2.1 免疫组化切片结果

本次实验各组免疫组化切片DAB染色结果图1至图4,图中可见Notch-1免疫组织化学染色阳性表达主要集中在神经节细胞层。与正常对照组 Control 1M 和Control 2M比较,糖尿模型组DM 1M 和DM 2M 组的视网膜神经节细胞层Notch-1阳性表达明显增强,DM 1M组和DM 2M组之间比较Notch-1表达略显增强。

图1 Control 1M Notch-l免疫组织化学染色结果(400×)

图2 Control 2M Notch-l免疫组织化学染色结果(400×)

图3 DM 1M Notch-l免疫组织化学染色结果(400×)

图4 DM 2M Notch-l免疫组织化学染色结果(400×)

2.2 免疫印迹结果

由图5可见Western blot条带经Gel-pro analyze 4.5分析显示糖尿病1月组和2月组Notch-1表达均明显高于正常组(P=0.003),但糖尿病1,2月组Notch-1表达无明显差异(P=0.56)。

图5 Western blot 结果图注Control 1M 为正常对照1月组,Control 2M 为正常对照2组,DM 1M 为糖尿病1月组,DM 2M 为糖尿病2月组,Beta-actin为内参,*为与Control 1M 和2M 比较差异有统计学意义(P=0.003),#为与DM 1M组比较,差异无统计学意义(P=0.56)

3 讨论

因血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在临床所带来的良好的治疗效果,所以大量研究几乎全部集中与与血管生成相关细胞因子的信号通路。但是临床发现,仍有部分病例使用抗VEGF后不能完全阻断视网膜新生血管的形成,另外还存在药物有效作用时间短、局部及全身副作用等问题,导致患者使用抗VEGF药物后疗效不佳[3-5]。近期研究发现Notch信号通路与各类型肿瘤发生发展有密切的联系,肿瘤细胞内有大量表达的Notch受体和配体,Notch信号通路的激活对于肿瘤的血管形成也有重要意义[1,6],所以Notch受体与配体的研究也成为抑制视网膜新生血管化的新的热点。糖尿环境下VEGF表达升高机理类似,Notch-1表达增加也与缺氧、氧化应激等有关[7]。另外研究也发现抑制Notch-1表达也能抑制VEGF表达升高所导致的糖尿病肾脏损害[8]。

本次研究虽然只是对早期糖尿病大鼠视网膜中Notch-1表达变化进行了简单研究,但发现正常对照组与糖尿病模型组的视网膜神经节细胞层见到阳性表达,且随糖尿病造模时间延长Notch-1表达有不断增加的趋势。本次研究同时发现Notch-1受体表达最为集中的在视网膜神经节细胞层,推断糖尿病早期对于眼部的损害最先损伤的也应该是视网膜神经节细胞层,所以下一步研究的主要是针对其对应配体Delta-like ligand 4在视网膜内层变化的研究。

[1] Li JL,Harris AL.Crosstalk of VEGF and Notch pathway in tumor angiogenesis:therapeutic implications.Front Biosci,2009,14(1):3094-3110.

[2] Bray SJ.Notch signalling:a simple pathway becomes complex.Nat Rev Mol Cell Biol,2006,7(9):678-689.

[3] Boyer DS,Hopkins JJ,Sorof J,Ehrlich JS.Anti-vascular endothelial growth factor therapy for diabetic macular edema.[J].Ther Adv Endocrinol Metab,2013,4:151-169.

[4] Falavarjani KG,Nguyen QD.Adverse events and complications associated with intravitreous injection of anti-VEGF agents:a review of literature.[J].Eye (Lond),2013,27:787-794.

[5] Cheung N,Wong IY,Wong TY.Ocular anti-VEGF therapy for diabetic retinopathy:overview of clinical efficacy and evolving applications[J].Diabetes Care,2014,37:900-905.

[6] Segarra M,et al.Dll4 activation of Notch signaling reduces tumor vascularity and inhibits tumor growth[J].Blood 2008,112:1904-1911.

[7] Yoon CH,Choi YE,Kohd SJ,et al．High glucose-induced jagged 1 in endothelial cells disturbs notch signaling for angiogenesis：A noveI mechanism of diabetic vasculopathy．

[8] Lin CL,Wang FS,et al.Modulation of notch-1 signaling alleviates vascular endothelial growth factor-mediated diabetic nephropathy.Diabetes,2010,59(8):1915-1925.

Expression of Notch-1 in retina of diabetic rats at early stage

GAONa

(ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu,Sichuan,610075)

Objective Notch receptors and the Delta-like ligand 4 signaling pathway was shown to participate in the process of diabetic retinopathy.However,the function of this signaling pathway in diabetic retinopathy was still unknown.So this study was designed to investigate the expression change of Notch-1 in early stage of diebetes mellitus (DM) of SD rats’ retina.Methods DM was induced in 2-month-old male 40 Sprague-Dawley rats,which were randomly divided into 4 groups (control 1 and 2 month group,DM model 1 and 2 month group).DM animal models were all set with 60mg/Kg streptozocin intraperitoneal injection.After 1 and 2 month,Notch-1 expression in retinal was detected with immunohistochemical stainning and western blot,and compared with that of 1 and 2 month control group.Results The immunohistochemical results showed that Notch-1 expressed intensly in diabetic rats retinal ganglion cell layer,which is expressed significantly higher than in normal rat．Western blot showed that the expression of Notch-1 protein were also higher in DM 1 month group and DM 2 month group than that in normal group,while there were no significant difference between the two DM groups.Conclusion The expression of Notch-1 increased in retinal ganglion cell layer of the early stage in diabetic rats,which may play an essential role in the process of diabetic retinopathy．

Diabetic mellitus; Diabetic retinopathy; Notch-1

610075,四川成都,成都中医药大学

高娜,E-mail:346508571@qq.com

10.3969/j.issn.1674-9006.2016.04.003

R774