陈博宇 王超英 陈维毅

·实验研究·

豚鼠早期实验性近视眼视网膜色素上皮细胞前部及后极部TGF-β2表达变化的研究

陈博宇1王超英1陈维毅3

目的 研究豚鼠早期实验性近视眼视网膜色素上皮(RPE)细胞前部及后极部转化生长因子β2(TGF-β2)的改变,探索近视的发病机制。方法 2周龄豚鼠30只随机分为A、B、C组,每组10只,再随机选取5只(10眼)正常2周龄豚鼠不作任何干预,作为正常对照眼。选取任意眼戴一10 DS凹透镜,分别饲养6天、15天、30天后除去镜片,验光及测眼轴长度确定近视形成后,采用细胞酶消化法培养豚鼠的前部及后极部RPE细胞,取3～6代RPE细胞进行免疫细胞化学、实时荧光定量PCR、western-blot蛋白印迹法检查前部及后极部RPE细胞TGF-β2及其mRNA、蛋白表达变化。结果 TGF-β2的表达定位于细胞浆和细胞核。实验组中前部RPE细胞于15天阳性表达率较高,30天阳性表达率最高;后极部RPE细胞于6天表达率开始较高,至15天阳性表达率最高,以后保持较高的阳性表达率,差异有显著性(P<0.05);SC组各组自身前部及后极部比较,差异无显著意义(P>0.05)。结论 体外培养的豚鼠RPE细胞稳定表达TGF-β2、TGF-β2 mRNA及其蛋白。且前部RPE细胞于诱导15天开始阳性表达率较高;后极部RPE细胞于诱导6天开始阳性表达率较高。后极部RPE细胞较前部RPE细胞表达差异有显著性。

豚鼠; 视网膜色素上皮细胞; 转化生长因子β2; 免疫细胞化学; 实时荧光定量PCR; Western-blot蛋白印迹法

视网膜色素上皮(RPE)细胞位于视网膜感觉上皮层与脉络膜之间,联系上皮与间充质,与多种细胞因子的分泌有关,对于稳定和维持视网膜功能有重要的作用,并且参与眼内多种疾病的发生发展。转化生长因子β2(TGF-β2)作为一种近视发生的信号分子,由RPE细胞分泌,并通过受体传递,逐级将信息传递到巩膜组织,进而影响巩膜细胞的增殖和(或)细胞外基质的合成或降解,使巩膜重新塑形,眼轴过度延长,形成近视。众所周知,近视眼形成的病理及生化改变存在的不同部位的差异,其变化主要发生在后极部,那么是否影响巩膜重塑的RPE细胞所分泌的因子也存在部位的差异？目前人们对豚鼠透镜诱导近视眼RPE细胞中TGF-β2的表达变化的研究罕有报道,而不同部位RPE细胞分泌因子的差异更无人报道,为此,本研究在成功建立透镜诱导近视眼模型的基础上,定位到前部及后极部RPE细胞,分析不同部位的TGF-β对在近视发生发展过程中起所起的作用,为进一步在细胞因子水平,对病理性近视眼发生机制的研究提供补充和相关的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 随机选取2周龄已脱离母乳喂养的小豚鼠30只(60只眼)分为A、B、C组,A组10只,B组10只,C组10只,再随机选取5只(10眼)正常2周龄豚鼠不作任何干预,作为正常对照眼(Norma-contro,NC组),雌雄不限,由河北医科大学实验动物养殖场提供。制备A、B、C组的LIM动物模型,诱导眼为实验组(LIM组),对侧眼为自身对照组(SC组)。实验眼是采用离焦点的方法用-10.00D[1]凹透镜诱导成近视眼模型。遮盖时间分别为6天、15天、30天。幼豚鼠于室内标准化喂养,白天用自然光照射,每日光照与黑暗的周期比例为14:10,室温控制在20℃。

1.1.2 凹透镜片(自行设计的 PMMA 镜片,部分参数如下:镜片直径 11.0mm,光学直径9.5mm,基弧为9.0,屈光度均为-10.00D上海菲士康视光有限公司)。

1.1.3 试剂

F12培养基、胰蛋白酶(美国Gibico公司);胎牛血清、小牛血清(杭州四季青公司);培养瓶、六孔板(美国Corning公司)。兔抗鼠Vimentin、Desmin、keratin、S-100I抗及免疫组化的剂盒(北京博奥森生物技术有限公司);DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司);转化生长因子-β2(TGF-β2)、(北京博奥森生物技术有限公司);Trozol Invitrogen公司USA;RNase Inhibitor Promega公司USA;M-MLV RT酶Promega公司USA;DNTP Promega公司USA;Taq酶(5u/μl)Sigma公司USA。

1.2 方法

1.2.1 RPE细胞的原代培养及鉴定

将豚鼠标记编号,验光及测眼轴长度。将三组豚鼠分别喂养6、15、30天后,摘除镜片,按前述方法验光及测眼轴长度。采用细胞酶消化法培养豚鼠的RPE细胞,用免疫细胞化学法对培养的细胞进行鉴定。

1.2.2 免疫细胞化学方法检测

1.2.2.1 实验方法

将长有RPE细胞的盖玻片放入湿盒内,每张玻片加50μl Triton室温下通透15分钟,PBS冲洗3×5min。链亲和霉素-过氧化物酶溶液浸泡6min,以消除内源性过氧化物酶的活性,PBS冲洗3×5min。高压锅加热抗原修复液处理2min,室温冷却20min,PBS冲洗3×5min。滴加稀释的50μl一抗(37℃孵育60min,PBS冲洗3×5min。滴加生物素标记的50μl二抗,室温40min,PBS冲洗3×5 min。DAB显色,取Iml蒸馏水加试剂盒中A,B,C试剂各一滴,混匀后加至玻片上,室温显色,镜下控制反应时间,一般在5-10min之间(胞浆呈棕黄色为阳性),蒸馏水充分洗涤终止显色时间。自来水充分冲洗,苏木素复染10min,梯度脱水,中性树脂封片。光学显微镜下观察结果。阴性空白对照:以PBS代替一抗,作阴性对照。

1.2.2.2 结果判定

由经验丰富的病理科技师采用双盲法独立观察,每张细胞爬片观察高倍镜(LM×400)下3个视野,阳性效应产物为棕黄色颗粒。阴性无表达;+着色浅,成淡黄色 高倍镜下明确阳性;++ 着色中等,棕黄色 低倍镜下明确阳性;+++ 大量,棕色 着色深;++++ 密集片状,深棕色 着色强烈。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测TGF-βmRNA

1.2.3.1 目的基因引物的合成

引物由上海生物工程公司合成。引物序列如下:GAPDH上游引物:5’-TGAACGGGAAGCTCAC TGG-3’下游引物:3’-GCTTCACCACCTTCTTGAT GTC-3’TGFβ124bp5’-CCCAGAGTGGTTGTCCT TTGA-3’5’-GCGGAGCGT GTTATCTTTGCT-3’

1.2.3.2 提取RNA的完整性检测及提取RNA的定量

标本及组织总RNA留取后,取RNA溶液4ul,经1%琼脂糖凝胶电泳检测,明显可见28S、18S条带,且28S为18S条带的两倍,5S条带较弱,且弥散,表明RNA降解较少,完整性良好。用756型紫外分光光度计分别测定OD260与OD280,OD260/OD280比值在1.8-2.0之间,表明提取的RNA蛋白污染很少,因此可于后续反转录反应。用756型紫外分光光度计测量OD260/OD280比值,可检测RNA的纯度和含量,选用OD260/OD280比值为1.8-2.0的RNA用作反转录。RNA含量采用紫外分光光度计检测法。

1.2.3.3 Syber Green荧光定量PCR检测:(Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits(SYBR Green I),BBI)

PCR热循环参数:96℃ 4min,然后三步反应:94℃ 30S,58℃ 30s,72℃ 30s,进行40个循环,于每个循环的第三步72℃ 30s收集荧光信号。选择数据分析方式,用实时荧光定量PCR结果分析。本试验采用相对定量法中的CT值比较法检验基因的表达变化。扩增完毕后,进入结果分析界面,以GAPDH为内参照基因,与对照组相比,得到目的基因表达的相对定量值(RQ值),我们将RQ值用于统计分析。

1.2.4 western-blot印迹法从蛋白表达水平定量检测TGF-β

1.2.4.1 蛋白质抽提及定量

收集各组细胞,用冷PBS洗涤3次后,将细胞重悬于细胞裂解液中,冰浴6 min,使细胞充分裂解。离心,收集上清,分装冻存。配置BCA工作液(WR);分别吸25ul标准品、待测样品.至微孔板对应孔中,每孔加入200ul的WR,震板6秒以彻底混合均匀:盖好微孔板,37℃孵育6分钟:冷却至室温;测量各孔590nm的吸光度值;测得的每个标准孔和待测样品孔的吸收值分别减去空白孔平均光吸收值;以校正过的BSA标准蛋白测量值对其浓度(ug/ml)做图绘制标准曲线。使用标准曲线定量待测样品蛋白浓度。

1.2.4.2 转PVDF膜

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳完毕后对凝胶进行半干转膜(转膜缓冲液为48 mmol/L Tris,39 mmol/L甘氨酸,1.3 mmol/L SDS,20 % 甲醇,pH 9.2)。半干式转膜槽阴极在上,阳极在下。缓冲液为连续缓冲液,蛋白质移动方向由上而下。转移电流50～250 mA,转移时间20～60 min。封闭:转膜完毕,取出 PVDF 膜,置于含5 % 脱脂奶粉的TTBS(10 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,60 mmol/L NaCl,0.05 % Tween-20)封闭液中,于室温封闭2 h。一抗结合:将封闭后的PVDF膜置入TTBS适当稀释的一抗溶液中,4 ℃缓慢摇动过夜。洗膜:取出PVDF膜放入盛有适量TTBS的平皿中,室温洗膜,每次10 min,共3次。二抗结合:将PVDF膜置入适量以TTBS 1:10000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗溶液中,于室温反应2 h。化学发光法检测:用TTBS室温洗膜3次,每次10 min,然后用TBS(10 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,60 mmol/L NaCl)洗膜1次,约5 min。抗体结合区带用化学发光法检测。信号强度用Bio 1D图像分析软件进行相对定量分析。

1.2.5 盲法处理

以上检影验光及所有测量均山另一位专业人员操作,操作人员不知被检眼是实验眼还是对照眼。

1.2.6 统计学处理

2 结果

2.1 细胞鉴定结果

细胞免疫化学法鉴定显示:RPE细胞keratin染色阳性,胞浆内可见大量棕色阳性反应产物,S-100染色弱阳性,胞浆内多呈棕黄色,Vimentin染色阴性,Desmin染色阴性,证实所培养的细胞为RPE细胞(Fig 1A-D)。

2.2 免疫细胞化学方法结果

TGF-β2的表达定位于细胞浆和细胞核。各诱导时间段前部及后极部RPE细胞均有TGF-β2的表达,LIM组前部及后极部与SC组相应前部及后极部比较,LIM组中TGF-β2的阳性表达率高于SC组,差异有显著意义(P<0.05)。LIM组中前部RPE细胞于15天阳性表达率较高,30天阳性表达率最高;后极部RPE细胞于6天表达率开始较高,至15天阳性表达率最高,以后保持较高的阳性表达率,差异有显著性(P<0.05);后极部RPE细胞于30天较前部RPE细胞阳性表达率仍有差异,差异有显著性(P<0.05);SC组各组自身前部及后极部比较,差异无显著意义(P>0.05)(Fig 4 A～F,Table 1)。

2.3 实时荧光定量PCR结果

各诱导时间段前部及后极部RPE细胞均有TGF-β2mRNA的表达,LIM组前部及后极部与SC组相应前部及后极部比较,LIM组中TGF-β2mRNA的表达量高于SC组,差异有显著意义(P<0.05)。LIM组中前部RPE细胞于15天表达量较高,至30天表达量最高;后极部RPE细胞于6天表达量较高,至15天表达量最高,以后保持较高的表达量,差异有显著性(P<0.05);后极部RPE细胞于30天较前部RPE细胞表达量仍有差异,差异有显著性(P<0.05);SC组各组自身前部及后极部比较,差异无显著意义(P>0.05)。(Fig 3,Table2)。

2.4 western-blot印迹法结果

各诱导时间段前部及后极部RPE细胞均有TGF-β2蛋白的表达,LIM组前部及后极部与SC组相应前部及后极部比较,LIM组中TGF-β2蛋白的表达量高于SC组,差异有显著意义(P<0.05)。LIM组中前部RPE细胞于15天表达量较高,至30天表达量最高;后极部RPE细胞于6天表达量较高,至15天表达量最高,以后保持较高的表达量,差异有显著性(P<0.05);后极部RPE细胞于30天较前部RPE细胞表达量仍有差异,差异有显著性(P<0.05);SC组各组自身前部及后极部比较,差异无显著意义(P>0.05)。(Fig 2,Table 3)

图1 豚鼠视网膜色素上皮细胞的细胞免疫化学法鉴定结果(×400)A:keratin(+);B:S-100(±);C:Vimentin(-);D:Desmin(-)

图2 豚鼠前部及后极部RPE细胞中TGF-β蛋白表达1:对照组前部;2:实验组前部(6days);3:实验组前部(15days);4:实验组前部(30days);5:对照组后极部;6:实验组后极部(6days);7:实验组后极部(15days);8:实验组后极部(30days)

Note:*P<0.05图3 豚鼠前部及后极部RPE细胞中TGF-βmRNA表达的对比1:实验组前部;2:实验组后极部;3:对照组前部;4:对照组后极部

图4 豚鼠RPE细胞中TGF-β的细胞免疫化学法阳性表达(×400)A:实验组前部(30days);B:实验组后极部(30days);C:实验组前部(15days);D:实验组后极部(15days);E:实验组前部(6days);F:实验组后极部(6days);G:对照组前部;H:对照组后极部

TGF-β2时间组别部位眼数-++++++++++阳性率诱导前实验组前部105122050%后极部105131050%对照组前部106211040%后极部105320050%6天后实验组前部104112260%c后极部101123390%a,b对照组前部106211040%c后极部105320050%c15天后实验组前部102031480%a,b后极部1000136100%a,b对照组前部105211150%c后极部104321060%c30天后实验组前部101022590%a,b后极部1000136100%a,b对照组前部107111030%c后极部106121040%c

注:实验组与对照组比较aP<0.05;实验组与诱导前比较;bP<0.05,对照组与诱导前比较;cP>0.05

表2 RPE细胞中不同时期TGF-βmRNA表达的对比

注:实验组与对照组比较aP<0.05,实验组与诱导前比较bP<0.05,对照组与诱导前比较cP>0.05

表3 RPE细胞中不同时期TGF-β蛋白表达的对比

续表3

时间点组别部位TGF-ββ-actionTGF-β与β-action的OD比值后极部95.367±2.153522.56±5.3780.1824±0.004c15天后实验组前部115.48±3.756522.13±5.5690.2211±0.008a,b后极部463.01±6.825520.34±4.8570.8898±0.015a,b对照组前部93.145±1.879518.37±5.4410.179±0.003c后极部98.215±1.285524.93±3.9910.1871±0.003c30天后实验组前部273.42±6.287523.16±3.5130.5210±0.014a,b后极部317.59±4.910524.78±3.0060.607±0.012a,b对照组前部99.147±1.740517.46±2.2340.1916±0.004c后极部96.582±2.315516.28±6.0390.1870±0.005c

注:实验组与对照组比较aP<0.05,实验组与诱导前比较bP<0.05,对照组与诱导前比较cP>0.05

3 讨论

TGF-β是一类对细胞生长、分化具有双向调节作用的细胞因子,它产生、利用和降解的部位主要在眼球的后极部,高表达于光感受器外节和RPE细胞,在脉络膜也有轻度表达,具有促进和抑制巩膜成纤维细胞的增生,从而进一步影响细胞外基质的构成,其生物活性以TGF-β2为主[2]。在生理状态下,RPE细胞与TGF-β的关系极为密切:目前研究已知不仅眼后段TGF-β的表达和分泌的重要来源地主要位于RPE细胞[3],而且反过来,通过自分泌或旁分泌产生的TGF-β还可以抑制RPE细胞增生[4]。另外,依据细胞类型的不同及与其他因子的共同作用的条件下,TGF-β又可发挥抑制或促进效应,从而达到双向调节眼内细胞间的活动的目的。以往的研究证实,当把外源性TGF-β加入人胚RPE细胞的培养基后,RPE细胞DNA的合成表现为抑制反应[5]。在研究小鸡形觉剥夺性近视(FDM)模型中,Seko[6]等人发现后极部巩膜组织及视网膜―视网膜色素上皮―脉络膜复合体中TGF-β2均有明显增加。TGF-β在实验性近视中或人眼近视中的可能机制为:在病理性近视眼的发生发展过程中,TGF-β可能作为一种“启动”信号因子,其表达水平显著升高[6,7],并经过与受体相结合,通过特定的信号传递系统,作用于视网膜、脉络膜或巩膜的细胞,对眼轴的生长和近视的形成起着重要的作用。

近年来的研究还表明,不同质量浓度的TGF-β不仅可抑制人胚RPE细胞的生长,改变RPE细胞的超微结构[9],还可诱导人胚RPE细胞向肌纤维母细胞转化,并与其剂量成正相关[10]。TGF-β可使人RPE细胞中MM P-2 mRNA的表达上调,直接改变MM P-T M P的平衡[8],从而改变细胞外基质的正常代谢,且有学者研究发现TGF-β的基因表达与高度近视无关联性[11]。可见TGF-β与近视的发生发展密切相关,它既可改变细胞的形态,又可影响与近视相关的细胞外基质的代谢和细胞内因子的分泌。

本研究成功建立了豚鼠透镜诱导近视眼动物模型,在实验中,我们希望通过分不同诱导时间、不同部位(前部和后极部)观察实验眼和对照眼RPE细胞TGF-β2及TGF-β2mRNA的动态表达变化,揭示TGF-β与近视眼后极部眼轴延长的关系。结果显示透镜诱导豚鼠近视眼RPE细胞中TGF-β2及TGF-β2mRNA的阳性表达率明显高于对照眼;各诱导时间段前部及后极部RPE细胞均有TGF-β2的表达,后极部RPE细胞于6天表达较高,前部无明显变化,前部及后极部的表达有显著性差异;前部RPE细胞于15天表达较高,至30天时,后极部表达较前部表达,仍有显著性差异。推测在透镜诱导豚鼠近视眼形成过程中,RPE细胞中TGF-β2活性升高从后极部开始,通过与下一级信使结合作用于后极部巩膜成纤维细胞;随着诱导时间推移,整体RPE细胞中TGF-β2的活性也升高,但仍以后极部为主,并稳定于一定浓度。因此.本研究首次揭示的RPE细胞的TGF-β表达的前后差异.很可能与巩膜的正常生长发育有关,并进一步与实验中近视的发生有关。本研究发现,体内的调节处于一种微妙的平衡状态,透镜诱导可以影响TGF-β的分泌平衡,造成豚鼠近视眼的形成和发展。

本研究由于时间有限,只对RPE细胞中TGF-β及TGF-βmRNA的表达进行了半定量及定量研究。RPE细胞中TGF-β有阳性表达,参与豚鼠实验性近视眼的形成,但是哪些信号使TGF-β表达发生改变,而TGF-β又是通过怎样的途径到达巩膜,引起巩膜改变的信号又是什么,抑制TGF-β的表达能否减轻近视眼眼轴延长,还有待于进一步研究,另外由于时间紧迫,未对“RPE-脉络膜级联系统”[12]中的脉络膜黑素细胞进行研究,下一步实验还有待完善。

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Altered TGF-β2 expression in retinal pigment epithelial(RPE)cells from an experimentally-induced myopia guinea pig model

CHENBo-Yu,WANGChao-ying,CHENWei-yi

(1.FromtheDepartmentofOphtalmology,theBethuneInternationalPeaceHospital,Shijiazhuang,Hebei,050082;3.DepartmentofBiomechianicsResearch,TaiyuanUniversityofTechnology,Taiyuan,Shanxi,030001)

Objective To observe the expression of transforming growth factor-β2(TGF-β2)in cultured guinea pig anterior and posterior retinal pigment epithelial(RPE)cells in lens-induced myopia(LIM).Methods Three groups(n=10)of two-week-old guinea pigs were used to develop concave lens-induced myopia(LIM)in one eye via the out-of-focus method for 6,15 or 30 d,respectively,while the other eye in each guinea pig served as the self-control(SC).After myopia induction,lenses were removed,and RPE cells were cultured and passaged twice.TGF-β2 expression levels of retinal pigment epithelial(RPE)cells in LIM and SC groups were compared by immunocytochemistry,quantitative real-time PCR(qRT-PCR)and Western blot analyses.All datas were statistically analyzed by SPSS 13.0 system.Results The TGF-β2 expression of the anterior portion of the RPE cells in the LIM group was significantly higher at 15 d and the highest at 30 d after myopia induction compared with the SC group(P<0.05).The TGF-β2 staining of the posterior RPE cells in the LIM group began to rise significantly at 6 d,peaked at 15 d and remained significantly higher than that of the anterior part,as well as the SC group,even at 30 d after myopia induction(P< 0.05).Conclusion During myopia development in lens-induced guinea pigs,the increase in TGF-β2 activity of RPE cells initiated at the posterior pole.Along with the induction time,the TGF-β2 activity in all RPE cells became elevated.

Guinea pig; Retinal Pigment epithelial(RPE)cells; Transforming growth factor-β2(TGF-β2); Immunocytochemistry; Real-Time PCR Analysis; Western blotting

《力学信号对实验性近视眼视网膜色素上皮细胞、巩膜成纤维细胞的影响》河北省自然科学基金资助项目(No.H2012505009)

1.050802,河北石家庄,白求恩国际和平医院眼科;2.030001,山西太原,太原理工大学大学生物力学研究所

陈博宇,E-mail:chenby2190@126.com

10.3969/j.issn.1674-9006.2016.04.002

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