·基础研究论著·

作者单位：510120 广州，中山大学孙逸仙纪念医院消化内科

1型糖尿病小鼠肠道潘氏细胞的杀菌功能改变

1型糖尿病是以慢性血糖升高为特征的代谢性疾病，主要由胰岛B细胞破坏，胰岛素绝对缺乏引起[1]。近年来，越来越多的临床调查研究提示1型糖尿病患者发生肠道细菌、病毒和真菌等病原体感染的几率显著增加[2-4]。在正常机体中，肠道黏膜的屏障功能是维持机体内外稳态的重要基础。其中，肠道黏膜上皮隐窝底部的潘氏细胞所分泌的溶菌酶在保持肠道菌群平衡以及抵御病原生物侵袭等方面起着极其重要的作用[5-6]。

研究显示，在肠道潘氏细胞的分化、成熟过程中主要受Wnt和Notch信号通路调控[7]。本实验组的前期研究发现，包括潘氏细胞在内，1型糖尿病小鼠的各种肠上皮细胞均存在分化比例的改变[8]。然而，在1型糖尿病的病理状态下，机体中的胰岛素绝对缺乏，除了诱发肠上皮细胞分化比例异常，是否影响潘氏细胞的成熟及其杀菌功能，目前相关报道不多，还需要进一步研究探讨。因此，本研究旨在探讨在1型糖尿病小鼠模型中肠道潘氏细胞杀菌功能的改变，以及恢复胰岛素水平对其功能的影响，为糖尿病肠道感染的相关研究提供实验依据。

材料与方法

一、主要试剂

链脲菌素购自Sigma公司；柠檬酸购自广州化学试剂厂；中性鱼精蛋白胰岛素购于诺和诺德公司；ELISA试验盒购于Merck Millipore公司；大肠埃希菌K12 ER2738菌株购于New England Biolabs公司，兔抗小鼠溶菌酶抗体购于Santa Cruz公司；免疫组织化学检查SP试剂盒购于迈新公司。

二、实验动物

实验动物为C57BL/6J小鼠，共30只，雌雄各半，8周龄，购于中山大学北校区实验动物中心，在中山大学北校区实验中心屏障环境中饲养。所有有关动物的实验过程均在中山大学实验动物伦理委员会的监督指导下完成，符合实验动物伦理学要求。

三、实验方法

1.糖尿病小鼠模型的建立

将30只C57BL/6J小鼠随机分为3组，每组10只：正常对照组(Control组)、1型糖尿病组(UDM组)、胰岛素治疗组(IDM组)。1%链脲菌素溶液由无菌0.1 mol/L柠檬酸缓冲液(pH=4.5)溶解链脲菌素制成，并立即对UDM及IDM组小鼠行腹腔内注射，剂量为70 mg/kg，1次/日，连续5 d。Control组给予相同体积的无菌0.1 mol/L柠檬酸缓冲液腹腔内注射，1次/日，连续5 d。1型糖尿病模型建模成功的条件为长期维持血糖大于16.7 mmol/L[9-10]。IDM组则给予造模成功的糖尿病小鼠皮下注射0.08 IU中性鱼精蛋白胰岛素，每日2次，直至实验结束[11-12]。第14周处死小鼠，沿腹部正中线行切开腹腔，取出靠近回肠末端10 cm片段进行后续实验。

2.ELISA检测血浆胰岛素水平

于试验终点时，使用心脏穿刺取血的方法抽取其血液进行离心(2 000×g, 4℃，15 min)，根据ELISA试剂盒说明书进行操作。根据标准曲线，检测各组血浆胰岛素水平。

3.菌落培养法评估肠道细菌增殖情况

取肠道片段进行研磨、稀释，然后取相同体积稀释液接种于培养平板。对于需氧细菌的培养，稀释液接种于胰蛋白胨大豆琼脂平板，在37℃的有氧环境中培养24 h；对于厌氧细菌的培养，稀释液接种于兔血琼脂平板，在37℃的无氧环境中培养48 h。最后平板上的菌落克隆数目计数，换算为单位质量肠道细菌总数(CFUs)。

4. 菌落培养法评估肠道对大肠埃希菌的清除能力

在第14周，用灌胃法注入0.1 ml碳酸氢钠溶液(0.1 M)，然后立即注入0.1 ml的大肠埃希菌溶液(2×1010CFUs)。该大肠杆菌为K12 ER2738菌株，对四环素耐药。3 h后杀死小鼠，收集肠道组织，进行研磨、稀释，然后取相同体积稀释液接种于含20 mg/L四环素的培养平板。统计平板上的细菌克隆数，计数单位体积细菌总数。

5.免疫组织化学法检测肠上皮溶菌酶的定性表达

组织切片行脱蜡、水化后，过氧化酶阻断剂孵育10 min，非免疫羊血清孵育10 min，溶菌酶一抗(1∶2 500稀释)4℃孵育过夜，二抗37℃孵育30 min，链霉素抗生物素过氧化物酶孵育10 min，二氨基联苯胺显色5 min，磷酸盐缓冲液终止显色，苏木素复染30 s。封片后光镜下观察溶菌酶阳性细胞的位置及表达情况。由2位研究者独立阅片，在400倍的观察条件下，计算视野中每个完整小肠隐窝单位溶菌酶阳性细胞的数目。随机选择15个视野计数分析，取其平均值。

6.蛋白免疫印迹法检测肠上皮溶菌酶的定量表达

肠组织研磨后用RIPA缓冲液提取蛋白，提取液在12%聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，然后电转至PVDF膜上。膜在溶菌酶一抗(1∶2 500稀释)或β-actin一抗(1∶2 000稀释)中4℃轻摇孵育过夜，在辣根过氧化物酶偶联的二抗室温孵育30 min。最后加入显色液，避光显色至出现条带。运用Glyko BandScan 5.0分析蛋白条带的灰度，以β-actin为内参。

四、统计学处理

结果

一、Control组、UDM组、IDM组的血糖和血浆胰岛素水平比较

与Control组比较，UDM组血糖明显升高(P<0.01)；接受胰岛素治疗可使IDM组小鼠血糖恢复正常，与Control组比差异无统计学意义(t=0.776，P>0.05)。UDM组血浆胰岛素水平较Control组明显下降(P<0.01)，而在胰岛素替代治疗的IDM组小鼠中，其胰岛素水平明显升高，与Control组比较差异无统计学意义(t=0.778，P>0.05)，见表1。

表1Control组、UDM组、IDM组的

注：与Control组比较，t血糖=20.170,t血浆胰岛素=12.332，aP<0.01

二、Control组、UDM组、IDM组的需氧菌总数、厌氧菌总数比较

与Control组比较， UDM组小鼠回肠末端的需氧菌总数多(P<0.05)；UDM组厌氧菌总数也较Control组多(P<0.05)；胰岛素治疗后的IDM组肠道需氧菌和厌氧菌总数均低于UDM组，与Control组比较差异无统计学意义(t需氧菌=0.162，t厌氧菌=0.305，P均>0.05)，见表2。

表2Control组、UDM组、IDM组的

注：与Control组比较，t需氧菌= 2.599，t厌氧菌=2.220，aP<0.05

运用灌胃法注入耐四环素的大肠埃希菌K12 ER2738菌株，该菌株在UDM组中的存活数明显高于Control组及胰岛素治疗后的IDM组(图1；P<0.05)，而IDM组同Control组比较无统计学差异(P>0.05)。上述结果提示，糖尿病小鼠的回肠末段细菌增多，抑菌能力减低。

图1　Control组、UDM组、IDM组大肠埃希菌

三、糖尿病小鼠回肠末端潘氏细胞溶菌酶表达减低

免疫组织化学结果显示，溶菌酶分子主要表达在肠隐窝底部的潘氏细胞的胞浆中，呈黄色或棕黄色颗粒(图2)。UDM组小肠上皮平均每个隐窝的溶菌酶阳性细胞数为(5.75±1.00)个，Control组为(4.46±0.96)个，2组比较差异有统计学意义(t=3.013，P< 0.05)；而IDM组和Control组对比无统计学差异[(4.39±0.85)个vs.(4.46±0.96)个,t=0.151，P>0.05]。蛋白免疫印迹法结果显示，UDM组的溶菌酶表达强度低于Control组(0.39±0.16vs. 0.79 ± 0.12，t=6.018,P< 0.01)；而IDM组和Control组对比无统计学差异(0.79 ± 0.16vs. 0.79 ± 0.12，t=0.081，P> 0.05)，见图3。

图2　Control组、UDM组、IDM组回肠末端潘氏细胞溶菌酶表达(免疫组织化学染色)

图3　Control组、UDM组、IDM组小鼠肠道

讨论

糖尿病肠道感染是糖尿病患者的常见并发症之一。近年来，一系列临床调查研究提示，1型糖尿病患者更容易发生肠道细菌、真菌、病毒等病原体感染，主要表现为腹痛、腹泻、吸收不良等临床表现，也可以呈无症状的隐性感染状态[1-4]。然而，其中的具体机制尚未完全阐明，目前考虑可能与内脏神经病变、胃肠运动障碍、肠道激素分泌紊乱等多个因素有关[13]。

Roza等[14]研究发现，1型糖尿病大鼠肠道细菌负荷增加，并且出现异常的细菌菌株，提示在肠道感染发生前可能已经存在肠道菌群的紊乱及细菌的过度生长。本次研究的结果表明，1型糖尿病小鼠在血糖持续升高后出现了回肠末端需氧菌和厌氧菌数量的明显增加，这与Roza等[14]研究相符，同时提示1型糖尿病小鼠可能存在肠道抑菌功能的下降，与其易发生肠道细菌感染有关。

为了评价1型糖尿病小鼠肠道的易感性，本课题组采用了K12 ER2738大肠埃希菌的菌株进行灌胃，并收集粪便进行四环素下的粪便细菌培养，这一方法可以有效去除肠道既有菌量、菌群的差异对研究结果的影响。结果显示，耐四环素的大肠埃希菌更容易在血糖升高的UDM组1型糖尿病小鼠肠道中存活。这进一步证明了1型糖尿病小鼠肠道对细菌的防御功能下降，清除病原体能力下降，对外来病原体的易感性增加。

肠道黏膜上皮隐窝底部的潘氏细胞可以产生及分泌溶菌酶，这一功能蛋白在局部肠道抑菌和防御作用方面发挥着重要的作用。本课题组既往的研究表明，1型糖尿病小鼠模型中肠道潘氏细胞数量增加，同时Notch/Hes1通路的表达减低提示其分化受抑制，但对其合成、分泌溶菌酶的状态及其抑菌功能未行进一步探讨[8]。本次研究表明，潘氏细胞在持续血糖升高后的1型糖尿病小鼠回肠末端的数量稍增加，同时，其产生及分泌的溶菌酶却明显减低。这一数量增加、功能减低的矛盾状态，提示1型糖尿病对小鼠肠道潘氏细胞的分化产生了抑制作用。

上述的潘氏细胞功能异常是否与1型糖尿病的低胰岛素水平有关，目前尚不清楚。本课题组采用的1型糖尿病小鼠模型原理是链脲菌素破坏胰岛细胞，导致其分泌胰岛素不足。结果显示，UDM组小鼠的胰岛素水平明显减低，而胰岛素替代治疗后的IDM组可使胰岛素水平恢复至正常对照小鼠的水平。后续的观察发现，1型糖尿病小鼠接受胰岛素替代治疗后，潘氏细胞的数目及其溶菌酶表达水平均可恢复至正常状态。同时，肠道细菌菌量及K12 ER2738大肠埃希菌的抑制作用也与对照组无统计学差异，提示胰岛素替代治疗恢复血糖水平后肠道局部的抑菌能力也得到恢复。这些结果证明潘氏细胞的功能障碍可以被胰岛素替代治疗所改善，同时，随着潘氏细胞功能的恢复，肠道的防御能力也得以提高。

综上所述，1型糖尿病小鼠肠道局部防御能力下降与潘氏细胞分泌溶菌酶减低有关，而胰岛素替代治疗可以恢复潘氏细胞溶菌酶的表达及肠道的抑菌能力。

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(本文编辑：杨江瑜)

杨洪生卢锡基于涛欧阳慧陈其奎

【摘要】目的探讨1型糖尿病小鼠肠道潘氏细胞杀菌功能的改变。方法采用腹腔注射链脲菌素的方法诱导1型糖尿病小鼠模型，8周龄小鼠分为正常对照组(Control组)、糖尿病组(UDM组)和糖尿病胰岛素治疗组(IDM组)。采用菌落培养法评估肠道细菌增殖情况及对外来大肠埃希菌的杀灭能力。利用免疫组织化学法和蛋白免疫印迹法检测潘氏细胞内溶菌酶的表达情况。结果与Control组比较，UDM组回肠末端有氧细菌总量增加(UDM组：5.66±0.80 lg CFUs/g，Control组：4.70±0.81 lg CFUs/g，P<0.05)，厌氧细菌总量也增加(UDM组：6.71±1.37 lg CFUs/g，Control组：5.25±1.16 lg CFUs/g，P<0.05)；UDM组肠上皮每个隐窝内潘氏细胞数目增多(UDM组：5.75±1.00个，Control组：4.46±0.96个，P<0.05)，但溶菌酶的蛋白质表达下降。IDM组与Control组比较，潘氏细胞数目、溶菌酶的蛋白质表达、肠道的细菌总量比较差异无统计学意义。结论1型糖尿病小鼠肠道防御能力下降，与潘氏细胞分泌溶菌酶不足有关，而胰岛素替代治疗可以恢复潘氏细胞溶菌酶的表达及肠道的防御能力。

【关键词】1型糖尿病；潘氏细胞；溶菌酶；胰岛素；肠道细菌

Changes in bactericidal function of intestinal Paneth cells in type 1 diabetic miceYangHongsheng,LuXiji,YuTao,OuyangHui,ChenQikui.DepartmentofGastroenterology,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China

Correspondingauthor，YuTao,E-mail:yutao2014@126.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the changes in the bactericidal function of intestinal Paneth cells in type 1 diabetes mellitus (T1DM) mouse models. MethodsT1DM mouse models were established by intraperitoneal injection of streptozocin (STZ). The 8-week-aged mice were divided into the control(Control), STZ-induced diabetic mice (UDM) and insulin-treated diabetic mice (IDM) groups. Bacterial culture was performed to evaluate the bacterial proliferation in the intestine and the bactericidal ability to eliminate foreign Escherichia coli. The expression level of lysozyme in intestinal Paneth cells was detected by immunohistochemistry and western blot. ResultsCompared to the Control group, the aerobe load of terminal ileum in the UDM group was significantly increased (UDM group：5.66±0.80 lg CFUs/g，Control group：4.70±0.81 lg CFUs/g，P<0.05), so was the anaerobe load (UDM group：6.71±1.37 lg CFUs/g，Control group：5.25±1.16 lg CFUs/g，P<0.05) and the quantity of Paneth cells in each crypt of intestinal epithelial cells (UDM group：5.75±1.00 per crypt，Control group：4.46±0.96 per crypt，P< 0.05). However, the expression level of lysozyme in the UDM group was decreased compared with that in the control group. No significant difference was noted between the IDM and control groups in terms of the quantity of Paneth cells, the expression level of lysozyme and overall bacterial load in the intestine. ConclusionsThe intestinal bactericidal function of the T1DM mice was decreased, which may result from the insufficient secretion of lysozyme by the Paneth cells. The insulin treatment can enhance the expression of lysozyme and restore the bactericidal function of the intestine in the T1DM mice.

【Key words】Type 1 diabetes mellitus; Paneth cells; Lysozyme; Insulin; Intestinal microbiota

收稿日期：(2015-08-06)

通讯作者，于涛，E-mail：yutao2014@126.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81370475)

DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2016.01.005