张 赛 梅晓云 周 岚

(南京中医药大学中医基础理论教研室，南京市 210023，E-mail：jessica826310@163.com)

论著·基础研究

补阳还五汤对腓总神经损伤大鼠腓总神经中神经生长因子mRNA表达的影响▲

张 赛 梅晓云 周 岚

(南京中医药大学中医基础理论教研室，南京市 210023，E-mail：jessica826310@163.com)

目的 探讨补阳还五汤对腓总神经损伤大鼠的腓总神经中神经生长因子(NGF)-mRNA表达的影响。方法 选取雄性无特定病原体级雄性SD大鼠48只分模型组、假手术组、弥可保组及补阳还五汤高、中、低剂量组各8只。除假手术组大鼠外，均建立腓总神经夹伤模型，术后假手术组与模型组分别用生理盐水灌胃，弥可保组及各剂量补阳还五汤组分别给予相应药物灌胃，其中补阳还五汤高、中、低剂量组所含生药分别为25.92 mg/g、12.96 mg/g、6.48 mg/g，21 d后检测大鼠腓总神经NGF-mRNA 表达情况。结果 假手术组、弥可保组与补阳还五汤低、中、高剂量组NGF-mRNA相对表达量明显增高，分别是模型组的4.79倍、2.16倍、1.31倍、1.83倍、3.41倍；补阳还五汤中剂量及高剂量组、弥可保组NGF mRNA相对表达量明显高于模型组(P<0.05)，补阳还五汤高剂量组NGF mRNA相对表达量明显高于弥可保组(P<0.05)。结论 补阳还五汤可明显增强腓总神经损伤大鼠腓总神经中NGF-mRNA的表达,这可能是补阳还五汤可促进腓总神经损伤后的修复及再生、肢体功能恢复的机制之一。

腓总神经损伤；补阳还五汤；腓总神经；神经生长因子；mRNA；大鼠；中医药；雪旺细胞

周围神经损伤后的再生与修复过程涉及多种因素且复杂多变。目前临床上尚无较为理想的、可快速促进神经及其靶器官功能恢复的方法。神经生长因子(nerve growth factor，NGF)与周围神经病变的关系密切[1]，其作为神经营养因子中重要的一员，对神经元的生长、修复与再生意义重大。有关复方补阳还五汤促进周围神经损伤修复的文献报告日益增多[2]。我们通过建立大鼠腓总神经夹伤模型，并检测神经NGF mRNA的表达，以了解补阳还五汤治疗大鼠腓总神经损伤的作用机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 无特定病原体级雄性SD大鼠48只，体重约200 g，由南京中医药大学实验动物中心提供，合格证编号：2008001646760。均于无菌饲养室、恒温20℃饲养。按随机数字表法将大鼠分为模型组、假手术组、弥可保组及补阳还五汤高、中、低剂量组，每组8只。

1.2 主要实验药品 (1)在南京中医药大学药学院制剂室制备补阳还五汤，采用黄芪120 g、当归6 g、芍药6 g、地龙3 g、川芎3 g、红花3 g、桃仁3 g进行煎煮、提取并浓缩，浸膏比重为3.7 g/ml，将该浸膏放于4℃冰箱，保存备用。(2)将甲钴胺片(弥可保，批号：H20041642，卫材(中国)药业有限公司，500 μg/片)溶解于双蒸水中，配制成混悬液，浓度为62.5 μg/ml。锡纸包装避光放置该溶液，现用现配。

1.3 主要实验试剂 Trizol购自Invitrogen公司(批号：15596-026)；焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate，DEPC)处理水购自南京森贝伽生物科技有限公司(批号：1001218)；氯仿、异丙醇、无水乙醇购自国药集团有限公司(批号分别为：10023419，80109218，10009218)；SYBR Green PCR试剂盒、反转录试剂盒购自Thermo公司(批号分别为：K0223，K1622)；RNaseⅠ购自Fermentas公司(批号：EN0541)；PCR 引物由武汉谷歌生物公司合成。其他常规试剂均为国药产品分析纯。

1.4 实验仪器 旋涡振荡器(上海青浦泸西仪器厂)、XW-80A微型旋涡混合仪(上海泸西分析仪器厂有限公司)、FastPrep-24样品处理系统(美国MP)、5424 R离心机(Eppendorf公司)、CFX Connect Real-Time PCR检测系统(BIO-RAD公司)、UPT优普特实验室超纯水器，离心管及 10 μl、200 μl、1 000 μl枪头等均为无RNA酶耗材。

1.5 腓总神经夹伤模型建立 在模型组、弥可保组及补阳还五汤高、中、低剂量组中建立模型。动物称重并麻醉消毒备皮，取左股后正中作一1.5 cm切口，游离后充分暴露腓总神经股部，向下行腓总神经钳夹术，以14 cm止血钳上全齿钳夹腓总神经3次，10 s/次且每次间隔10 s。挤压损伤宽度为5 mm，损伤远端标记后逐层缝合。全部模型由同一人同手法操作。而假手术组大鼠只进行胫前肌外皮切口并缝合，不夹伤内部腓总神经。

1.6 给药方法 造模后第2天开始灌胃给药，给药剂量根据成人临床使用剂量，根据每公斤体重占体表面积相对比值的换算公式计算：大鼠每日给药剂量(mg/g)=成人每日给药剂量(mg)×等效剂量比值(人对大鼠为0.018)/大鼠体重(g)。补阳还五汤高剂量组为临床换算剂量的2倍量(25.92 mg/g)，高、中、低剂量组含生药分别是25.92 mg/g、12.96 mg/g、6.48 mg/g，中药浸膏均用生理盐水稀释至4 ml后灌胃。假手术组与模型组分别用4 ml生理盐水灌胃。弥可保组药物剂量为625 mg/g，终体积4 ml灌胃。给药时间固定为每日上午9 ∶00，1次/d。

1.7 腓总神经指标检测 应用实时荧光定量PCR检测NGF mRNA的表达。

1.7.1 引物合成：磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因为参照基因。根据NCBI数据库中的NGF基因序列及GAPDH基因序列，以Premier 5.0软件设计引物,由武汉谷歌生物有限公司合成。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.7.2 总RNA制备：术后灌胃21 d后处死大鼠，暴露腓总神经，沿神经损伤远端取神经组织30 mg并放入冻存管中，置于液氮，后转到-80℃冰箱保存备用。

1.7.3 互补DNA(complementary DNA，cDNA)的合成：将神经组织加入1 ml Trizol匀浆静置，加入氯仿，12 000 r/min离心10 min，取上清。加入异丙醇，12 000 r/min离心15 min，弃上清。加入乙醇洗涤沉淀弃上清。晾干加入适量焦碳酸二乙酯处理水溶解。合成cDNA的第一条链反应体系如下：首先消除总RNA中的DNA，需加入脱氧核糖核酸酶I(deoxyribonuclease Ⅰ，DNaseⅠ)1 μl、10×DNase Ⅰ 缓冲液1 μl、总RNA≤1 ng、焦碳酸二乙酯处理水n μl，调整温度至37℃ 30 min。加 1 μl的乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)，调制温度至65℃ 10 min；后加入1 μl的Oligo 18、1 μl的双蒸水(ddH2O)，65℃加热10 min，结束后迅速置于冰上冷却。进行反转录，加入下列体系：全部RNA 500 ng；5×反应物缓冲液4 μl；Oligo 18引物1 μl；10 mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸混合物2 μl；RiboLock RNase抑制剂1 μl；RevertAid M-MuLV RT 1 μl；加入无酶ddH2O至20 μl；反应程序如下：温度调至42℃ 60 min，上升至70℃ 5 min后冷却到16℃，将反转录产物置于-20℃冰箱，保存备用。

1.7.4 定量PCR检测 20 μl体系：将制备好的 cDNA 进行 PCR 扩增，扩增体系如下：将PCR扩增的预混和溶液(SYBR Green Mix)10 μl、上游引物 F 0.5 μl、下游引物 R 0.5 μl、cDNA模板1 μl、ddH2O 8 μl混匀，总体积20 μl，置于SLAN荧光定量PCR仪中。反应程序：升温至95℃，3 min；95℃，1～3 s，退火至60℃，≥20 s，40个循环；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s。反应结束后保存数据。通过溶解曲线来判断PCR反应的特异性。每个组分别做3次定量检测，记录下CT值，并最终计算出CT平均值、△CT、△△CT和2-△△CT。其中△CT=CT(NGF)-CT(GAPDH)，△△CT=△CT(各组)-△CT(模型组)，运用2-△△CT相对定量差异法统计各组与模型组NGF mRNA基因表达的差异。

1.8 统计学分析 采用SPSS16.0进行统计学分析，计量资料采用(x±s)来表示，比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 术后大鼠一般情况 术后第2天所有大鼠手术侧出现了足趾蜷缩、跛行。21 d后各组足趾明显伸展，步态基本恢复正常，假手术组、弥可保组及补阳还五汤高、中、低剂量组大鼠精神状态及毛发色泽均优于模型组。除假手术组外，其余各组的手术侧均呈现出不同程度的胫前肌肌肉萎缩。

2.2 治疗后各组大鼠腓总神经的NGF基因表达情况 6组的NGF-mRNA基因相对表达量比较，差异有统计学意义(P<0.05)，假手术组、弥可保组与补阳还五汤低、中、高剂量组NGF mRNA基因相对表达量较模型组明显增高，分别是模型组的4.79倍、2.16倍、1.31倍、1.83倍、3.41倍；其中补阳还五汤中剂量及高剂量组、弥可保组NGF mRNA相对表达量明显高于模型组(P<0.05)，补阳还五汤高剂量组NGF mRNA相对表达量明显高于弥可保组(P<0.05)。见表2。

表2 6组NGF-mRNA基因相对表达量的比较(x±s)

注：与模型组相比，*P<0.001，△P<0.01；与弥可保组相比，#P<0.001。

3 讨 论

NGF是一种分子量为27 KD的多肽，是一个高度保守的蛋白家族[3]。其细胞效应通过细胞表面两类截然不同的受体介导[4]，主要存在于交感神经元及部分感觉神经元所分布的靶区域内的细胞组织中。受体酪氨酸激酶(tyrosine kinase，Trk)家族和NGF家族成员呈相对特异高亲和结合，特别是TrkA和NGF结合[5]。NGF的另外一个受体P75NTR和NGF家族成员呈低亲和结合。NGF是神经系统最重要的生物活性分子之一，是目前唯一明确化学结构的细胞生长调节因子，具有促进周围神经损伤与修复作用[6]，其作用具体表现为：控制神经元的存活，促进神经元的分化，决定轴突的生长方向及营养作用。研究表明，NGF蛋白及其受体表达减少的同时周围神经中的NGF基因表达也减少[7]。由于现代分子生物学技术的发展，以NGF-mRNA在神经组织中的表达情况来评估神经再生，其敏感性明显高于检测NGF的表达情况[8]。大量细胞和分子水平的研究证实神经再生离不开雪旺细胞的增殖[9]。而Heumann等[10]研究表明神经损伤后的NGF-mRNA的高表达主要来源于局部增殖的雪旺细胞。雪旺细胞分泌NGF以维持神经元生存和促进轴突再生，如周围神经损伤后，雪旺细胞的增殖受阻，必然导致神经元的凋亡，抑制轴突的再生。

腓总神经损伤是病因病机和临床表现可将其归于中医“痿证”范畴，周围神经损伤，首先出现局部的气滞血淤，受到其支配的远端肌肉群由于失去神经的营养供应，便逐渐发展为萎缩和变性，此当属本虚标实之证，病机为经气不续、气虚血滞，应以补气活血化淤为治则。补阳还五汤出自清代医家王清任的《医林改错》，是补气活血的代表方，方中以大量补气药(黄芪120 g)搭配少量活血药(桃仁、红花、赤芍、川芎、地龙)，活血而不伤正，补气活血通络。有临床研究报道补阳还五汤临床广泛用于腰腿疼痛麻痹、周围神经性面瘫、糖尿病周围神经等病变，且疗效确切[11]。本研究结果显示，治疗后21 d，补阳还五汤中剂量及高剂量组、弥可保组大鼠腓总神经的NGF-mRNA相对表达量明显高于模型组(P<0.05)，而补阳还五汤高剂量组NGF-mRNA表达明显高于弥可保组(P<0.05)，提示不同剂量的补阳还五汤均可增强腓总神经损伤大鼠的腓总神经中NGF-mRNA的表达，推测该方有可能促进NGF与新生雪旺细胞对溃变髓鞘的清除能力，同时使雪旺细胞的NGF-mRNA表达增加，从而促进轴突生长以加速神经的再生，使周围神经的结构和功能得到了保护，这可能是其治疗腓总神经损伤的重要靶点之一。

综上所述，补阳还五汤可明显增强腓总神经损伤大鼠腓总神经中NGF-mRNA的表达，这可能是补阳还五汤促进腓总神经损伤后的修复与再生以恢复肢体功能的机制之一。

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Effect of Buyanghuanwu decoction on nerve growth factor mRNA expression of common peroneal nerve in rats with common peroneal nerve injury repairing

ZHANGSai1,MEIXiao-yun1,ZHOULan2

(DepartmentofBasicalTraditionalChineseMedicalCollege,NanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210023 210023,China)

Objective To explore the effect of Buyanghuanwu decoction on nerve growth factor(NGF) mRNA expression of common peroneal nerve in rats with common peroneal nerve injury.Methods A total of 48 male specific pathogen free SD rats were divided into model group,sham operation group,methycobal group,high-dose Buyanghuanwu decoction group,medium-dose Buyanghuanwu decoction group and low-dose Buyanghuanwu decoction group,with 8 rats in each group.Common peroneal nerve crush models were established in all the rats except the rats in the sham operation group.After operation,sham operation group and model group were treated with normal saline by gavage,while methycobal group and all Buyanghuanwu decoction groups were given corresponding transgastric medication.And the pure drugs in the high-,medium- and low-dose Buyanghuanwu decoction groups were 25.92 mg/g,12.96 mg/g and 6.48 mg/g,respectively.NGF mRNA expression was determined in the common peroneal nerve of rats 21 days later.Results Relative expression levels of NGF mRNA in the sham group,methycobal group,low-,medium- and high-dose Buyanghuanwu decoction groups increased significantly,and were 4.79 times,2.16 times,1.31 times,1.83 times and 3.41 times the relative expression levels in the model group respectively.Relative expression levels of NGF mRNA in the medium- and high-dose Buyanghuanwu decoction groups and methycobal group were significantly higher than that in the model group(P<0.05),and relative expression level of NGF mRNA in the high-dose Buyanghuanwu decoction group was significantly higher than that in the methycobal group(P<0.05).Conclusion Buyanghuanwu decoction can significantly elevate NGF mRNA expression of common peroneal nerve in rats with common peroneal nerve injury.It may be one of the mechanisms that Buyanghuanwu decoction can promote the repairing and regeneration of injured common peroneal nerve,and recovery of limb function.

Common peroneal nerve injury,Buyanghuanwu decoction,Common peroneal nerve,Nerve growth factor,Message RNA,Rat,Traditional Chinese medicine,Schwann cell

国家自然科学基金，青年科学基金项目(81302890)； 江苏省高校自然科学基金面上项目(13KJB360003)；江苏省自然科学基金面上项目 (BK2011816)； 高等学校博士学科点专项科研基金面上项目 (新教师类)(20123237120004)；南京中医药大学青年自然科学基金(12XZR09)

张赛(1988～)，女，硕士，见习医师，研究方向：中医基础理论。

梅晓云(1954～)，女，硕士，博士生导师，研究方向：中医基础理论，E-mail：xiaoyun663399@163.com。

R 651.3

A

0253-4304(2016)01-0007-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.01.02

2015-11-14

2015-12-30)