崔亚威 陈铭伍 王永勇 谭 翔 欧 进 冼 磊 郭建极 阳 诺 戴 磊 梁冠标

(广西医科大学第一附属医院心胸外科，南宁市 530021，E-mail：cuiyawei1121@126.com)

肌球蛋白轻链激酶mRNA在非小细胞肺癌患者外周血的表达情况及其临床意义▲

崔亚威 陈铭伍 王永勇 谭 翔 欧 进 冼 磊 郭建极 阳 诺 戴 磊 梁冠标

(广西医科大学第一附属医院心胸外科，南宁市 530021，E-mail：cuiyawei1121@126.com)

目的 探讨肌球蛋白轻链激酶(MYLK)mRNA在非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血的表达情况及其与临床特征的关系。方法 48例NSCLC患者(肺癌组)和48例非肿瘤患者(对照组)，抽取静脉血后分离出单个核细胞，使用实时荧光定量PCR检测MYLK mRNA的表达情况，并分析其表达量与临床特征的关系。结果 肺癌组及对照组患者外周血均有MYLK mRNA表达，肺癌组患者MYLK mRNA表达量为(1.40±0.57)，明显低于对照组的(2.03±0.16)(P<0.05)；术前组与术后组、鳞癌组与腺癌组、高+中分化组与低分化组、男性组与女性组、吸烟组与不吸烟组的MYLK mRNA相对表达量比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)；Ⅲ+Ⅳ期组患者、有淋巴结转移组患者MYLK mRNA相对表达量分别高于 Ⅰ+Ⅱ 期组、无淋巴结转移组患者(P<0.05)。结论 外周血MYLK mRNA的表达水平可能与NSCLC发生发展有关，对判断NSCLC预后有一定价值。

非小细胞肺癌；肌球蛋白轻链激酶；信使RNA；外周血

目前肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，近年来全球肺癌发病率略有下降，但仍然是癌症死亡的主要原因，尤其在发展中国家[1]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌85%以上，即使是手术Ⅰ期完全切除的患者，仍有超过1/4的患者术后短期内复发转移，提示外周血循环中可能存在循环肿瘤细胞，严重威胁患者生命[2-3]。目前，肺癌的发生被认为是一个多基因参与、多步骤发展的复杂生物学过程，也涉及多种信号转导通路。已知吸烟、遗传、职业暴露和大气污染等因素与肺癌发生发展密切相关。有研究发现肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase，MYLK)的表达变化与胃癌、结肠癌等发生发展密切相关[4-5]，但有关其与肺癌的关系的研究甚少，我们前期已采用基因富集等生物信息学方法筛选出与NSCLC发生发展的关键基因之一MYLK[6]，并发现在NSCLC组织中MYLK mRNA及蛋白的表达水平低于癌旁及正常组织，但其在患者外周血的表达情况尚不清楚[7]。因此，本研究采用实时荧光定量PCR检测NSCLC患者外周血MYLK mRNA的表达情况，探讨其表达水平与NSCLC患者临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集广西医科大学第一附属医院胸外科2014年11月至2015年7月收治的经手术切除治疗且病理检查证实为NSCLC的患者48例(肺癌组)，根据国际抗癌联盟系统进行肿瘤TNM分期[8]。男性38例，女性10例，年龄30～75岁。纳入标准：均无全身系统性病变或其他器官良、恶性肿瘤；术前均未经放、化疗及靶向治疗。选取同期48例非肿瘤患者作为对照组，其中气胸患者16例，无感染及肿瘤的神经内科疾病患者32例；男性38例，女性10例，年龄16～60岁。两组患者的年龄、性别比较，差异无统计学意义(P>0.05)。所有血样抽取均取得患者及其家属同意以及伦理委员会批准。

1.2 主要仪器与试剂 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒均为TAKARA公司的产品；Trizol试剂和buffer EL红细胞裂解液分别为Invitrogen公司和QIAGEN公司的产品；UVI FireReader凝胶成像分析系统生产于英国UVItec公司；Tromor 4实时荧光定量PCR仪购买于Bio-Rad公司；MR23i高速多功能冷冻离心机和NanoDrop ND-2000微量紫外分光光度仪均购自美国Thermo公司生产。

1.3 实时荧光定量PCR

1.3.1 引物的设计与合成：在Genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中查询人类MYLK和看家基因β-肌动蛋白(ACTB)基因的cDNA序列，使用Oligo7软件设计引物，引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。各基因引物的序列见表1。

表1 各基因引物的序列

1.3.2 RNA提取：取肺癌组患者(术前及术后)及对照组外周静脉血2 ml，使用buffer EL红细胞裂解液将红细胞裂解后离心分离出外周血单个核细胞。加入1 ml Trizol试剂混匀，室温放置5 min，加200 μl三氯甲烷并充分混匀，于4℃条件下13 000 r/min离心15 min，取上清置入新离心管，加入500 μl异丙醇，混匀后冰上静置10 min，于4℃条件下13 000 r/min离心10 min，倒掉上清液，加入75%的乙醇 1 ml，充分吹打洗涤，4℃条件下13 000 r/min离心5 min，倒掉上清液后空气中自然干燥，加入适当的RNase free水混匀，用微量紫外分光光度仪测定RNA的浓度和纯度。纯净RNA样本A 260 nm/A 280 nm的比值均大于2.0。

1.3.3 cDNA合成与鉴定：cDNA的合成反应按PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明书进行，用ACTB引物对cDNA进行检测，退火温度为60℃，三步法进行PCR扩增，反应的循环数为32，PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，在凝胶成像分析系统下，可在225 bp左右看见条带。

1.3.4 实时荧光定量PCR：使用Tromor 4实时荧光定量PCR仪进行扩增，反应体系为20 μl，两步法PCR扩增程序如下：第1步：95℃ 30 s，1个循环；第2步：95℃ 5 s，退火温度 60℃ 30 s，反应循环数为40。反应完毕后取5 μl产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果。

1.4 实验数据的处理 荧光定PCR结果以ACTB基因作为内参，将非肿瘤患者为对照组，并将其目的基因表达量设为1，采用2-△△Ct法计算实验组目的基因的表达相对于对照组目的基因表达量变化的倍数。

1.5 统计学分析 采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，计量资料以(x±s)表示，采用t检验，方差不齐的两组数据则采用近似t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组患者外周血MYLK mRNA表达比较 各样本RNA经反转录成cDNA后，扩增检测反转录产物质量(图1)。肺癌组患者及对照组患者外周血均有MYLK mRNA表达，肺癌组患者治疗前后的平均MYLK mRNA表达量为(1.40±0.57)，明显低于对照组患者的(2.03±0.16)(t=-3.185，P=0.010)。

图1 ACTB及MYLK基因的溶解曲线及扩增曲线

注：A为ACTB溶解曲线，B为ACTB扩增曲线，C为MYLK溶解曲线，D为MYLK扩增曲线。

2.2 不同临床特征患者MYLK mRNA表达量比较 48例NSCLC患者中，术前组与术后组、鳞癌组与腺癌组、高+中分化组与低分化组、男性组与女性组、吸烟组与不吸烟组间的MYLK mRNA相对表达量比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)；Ⅲ+Ⅳ期组患者MYLK mRNA相对表达量明显高于Ⅰ+Ⅱ期组(P<0.05)；有淋巴结转移组患者MYLK mRNA相对表达量明显高于无淋巴结转移组患者(P<0.05)，见表2。

表2 不同临床特征患者外周血MYLK mRNA相对表达量比较

3 讨 论

MYLK广泛存在于各种真核细胞及非肌肉性细胞中，是一种钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸/苏氨酸激酶，属于免疫球蛋白超家族[9]。MYLK主要是通过磷酸化方式使内皮细胞上的肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC)磷酸化，在MLC 氨基端的特异位点(苏氨酸-19)上进行磷酸化，随后通过丝氨酸-18 诱导三磷酸腺苷依赖的肌动球蛋白收缩，内皮细胞骨架重塑，从而调节内皮细胞通透性，促进肌球蛋白驱动收缩、应力纤维形成、黏着、细胞迁移和细胞分裂[10]。

MYLK mRNA参与胃癌细胞的增殖、凋亡、侵袭与转移过程。Lee等[5]研究发现MYLK mRNA在结肠癌组织的相对表达量明显低于癌旁组织，起了抑癌基因的作用。有研究表明乳腺癌患者MYLK参与p38-丝裂原活化蛋白激酶通路，MYLK抑制剂如MLJ-7，可以降低MYLK的表达，导致成纤维细胞变圆，有效减少癌细胞的增殖及转移，进而诱导乳腺癌细胞凋亡[11]。白藜芦醇通过下调肝组织MYLK 的表达水平诱导肿瘤细胞凋亡，从而抑制大鼠肝肿瘤细胞的增生[12]。但近年来关于MYLK与NSCLC关系的研究报告甚少。Minamiya等[13]首次报告了MYLK mRNA与NSCLC患者的预后情况，发现复发转移的NSCLC患者MYLK mRNA 表达水平明显增高。本研究结果显示，在NSCLC患者及非肿瘤患者外周血中均有MYLK mRNA表达，但NSCLC患者的表达量明显低于非肿瘤患者(P<0.05)。谭翔等[7]的研究结果发现NSCLC癌组织中MYLK mRNA表达量明显低于癌旁组织及正常肺组织(P<0.05)，表明在NSCLC患者的癌组织及外周血中MYLK mRNA均呈低表达。有研究表明，在肿瘤细胞中，MYLK的假基因MYLKP1能降低MYLK mRNA的稳定性，甚至抑制其表达来刺激细胞增殖[14]，但MYLKP1是否对MYLK的表达起调控作用仍需进一步研究。

分析MYLK基因在不同临床病理特征NSCLC患者中的表达特点，对于判断肺癌局部生物学行为、复发及预后具有重要意义。本研究结果表明，NSCLC患者术前与术后MYLK mRNA的表达无差异(P>0.05)，这可能与该组患者术前、术后取血标本的时间周期短有关，仍需进一步追踪随访。在鳞癌与腺癌、高+中分化与低分化、男性与女性、吸烟与不吸烟的NSCLC患者血中MYLK mRNA相对表达量比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)，但Ⅲ+Ⅳ期组患者MYLK mRNA相对表达量明显高于Ⅰ+Ⅱ 期组，有淋巴结转移组患者MYLK mRNA相对表达量明显高于无淋巴结转移组患者(P<0.05)，这可能与在外周血中MLCK使肌球蛋白轻链MLC磷酸化，导致细胞连接破坏、细胞骨架重排、血管内皮细胞收缩，并最终增加血管内皮细胞的通透性有关[15]；或是通过MYLK或Rho激酶调控肿瘤细胞黏附而引起内皮细胞膜表面受体与细胞骨架之间的信号转导，并通过调控肌球蛋白轻链的磷酸化水平，引起肌球蛋白与肌动蛋白相互作用，导致肿瘤细胞向血管外游走，并向远处转移[16]。本文研究结果与Tan等[6]的研究结果基本一致，表明外周血MYLK mRNA表达量与NSCLC的分期有关，分期越高表达量越高，这对患者的预后判断有重要价值。此外，Tan等[6]也报告MYLK可能在黏着斑通路上参与调控细胞骨架重塑，增强细胞移动及细胞黏附、细胞侵袭能力。

综上所述，NSCLC患者外周血MYLK mRNA表达明显降低，并其表达量与患者的分期及淋巴结转移有关，该指标有可能成为研究NSCLC发生发展及评估预后的一个重要的预警因子及治疗NSCLC的新靶点。

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Expression and clinical significance of myosin light chain kinase message RNA in peripheral blood of patients with non-small cell lung cancer

CUIYa-wei,CHENMing-wu,WANGYong-yong,TANXiang,OUJin,XIANLei,GUOJian-ji,YANGNuo,DAILei,LIANGGuan-biao

(DepartmentofCardiothoracicSurgery,theAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To explore the expression of myosin light chain kinase(MYLK) message RNA(mRNA) in peripheral blood of patients with non-small cell lung cancer(NSCLC),and to investigate the relationship of MYLK mRNA expression with clinical characteristics.Methods Mononuclear cells were isolated from the venous blood of 48 patients with NSCLC(lung cancer group) and 48 patients without tumor(control group).And then the expression of MYLK mRNA was detected by real-time quantitative PCR,and the relationship between the expression level of MYLK mRNA and clinical characteristics was analyzed.Results MYLK mRNA was expressed in peripheral blood of the patients in lung cancer group and control group.The expression level of MYLK mRNA of the patients in lung cancer group was (1.40±0.57),and was significantly lower than that of control group(2.03±0.16)(P<0.05).For patients with NSCLC,there was no significant difference in the relative expression level of MYLK mRNA between two different subgroups,including preoperative group and postoperative group,squamous cell carcinoma group and adenocarcinoma group,well-differentiated+moderated differentiated group and poor-differentiated group,male group and female group,smoking group and non-smoking group(P>0.05).The relative expression levels of MYLK mRNA in patients with stage Ⅲ+Ⅳ and with lymphatic metastasis were significantly higher than those in patients with stage Ⅰ+Ⅱ and without lymphatic metastasis respectively(P<0.05).Conclusion The expression level of MYLK mRNA in peripheral blood may be closely related to the occurrence and development of NSCLC,and it is valuable for evaluating the prognosis of NSCLC to a certain extent. 【Key words】 Non-small cell lung cancer,Myosin light chain kinase,Message RNA,Peripheral blood

广西壮族自治区高等学校科学研究项目(桂教立项项目KY2015LX053)；广西科学研究与技术开发计划(桂科攻10124001A-47)

崔亚威(1990～)，男，在读硕士研究生，研究方向：肺癌、食管癌及心脏疾病等临床及科研。通信作者：陈铭伍(1959～)，男，硕士，教授，硕士生导师，研究方向：肺癌、食管癌及心脏疾病等临床及科研，E-mail：chen535@126.com。

R 734.2

A

0253-4304(2016)02-0171-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.02.07

2015-10-10

2015-12-31)