阳小飞，荣伊，周仲燕

(中南民族大学 生物医学工程学院，脑认知国家民委重点实验室，医学信息分析及肿瘤诊疗湖北省重点实验室，膜离子通道与药物研发实验室，武汉430074 )

在神经网络中，神经元细胞间的信号传递需要囊泡释放包裹的神经递质，单个囊泡释放出的神经递质与突触后膜上的受体结合，引起电流的变化，即微小型兴奋性突触后电流(mEPSC)或微小型抑制性突触后电流(mIPSC)[1,2].神经元细胞中可释放囊泡库(RRP)[3]的大小影响囊泡的自发性释放.Ca2+在囊泡释放中发挥重要作用.当囊泡靠近突触前膜时，随着Ca2+的通透性增加，细胞外的Ca2+内流，推动囊泡与突触前膜的融合、释放，引起突触后的电位变化[4-6].在正常情况下，当细胞内Ca2+浓度过高时，激活某些蛋白酶、磷脂酶及内源性核酸酶等，导致细胞凋亡[7]；但当神经元细胞内Ca2+浓度过低甚至无Ca2+存在时，对细胞会造成什么样的影响，目前尚无定论.

BAPTA-AM是一种乙酰甲酯衍生物，细胞膜对其通透性较强，当它进入细胞内，在酯酶的作用下分解出BAPTA，后者是一种高效Ca2+络合剂，它亲和力强，能快速与细胞内游离的Ca2+结合，在细胞内营造出无Ca2+的状态[8,9].运用此方法，可有效地去除细胞内Ca2+.本文通过全细胞膜片钳记录的方法，探讨去除细胞外Ca2+及同时去除细胞内外Ca2+，对大脑皮层神经元自发性囊泡释放的影响及原理，为研究中枢神经系统的囊泡分泌提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

胎牛血清、MEM培养基、0.25%胰蛋白酶、转铁蛋白、B-27 supplement(Gibco)；BAPTA-AM、胰岛素、葡萄糖、HEPES 、阿糖胞苷、EGTA、多聚赖氨酸(Sigma)；二甲苯、丙酮、无水乙醇等(国药集团化学试剂)；印防己毒素,Tocris 1128,1 g；河豚毒素,Affix Scientific 4368-28-9,1 mg；CNQX,Tocris 1045,10 mg.

倒置显微镜(Olympus)；全套自动膜片钳放大器(HEKA)；P-97微电极拉制仪(普升科技)；CO2恒温细胞培养箱(Thermo)；超净工作台产(苏州Air Tech)；高压灭菌锅(上海博讯).

1.2 实验溶液配制

按照文献[10,11]，配制神经元解剖液、神经元培养基、电生理正常细胞外液、0 Ca细胞外液、电生理细胞内液、10 mmol/L BAPTA-AM 母液(溶于DMSO).

1.3 原代鼠脑皮层神经细胞的获取

取出生<24 h的新生KM小鼠，无菌环境下断头取脑，分离出大脑皮层，用0.25%的胰蛋白酶在37 ℃恒温环境中消化12 min，用神经元培养基离散细胞后，滴种在用多聚赖氨酸处理过的玻片上，放入细胞培养箱，分别在第1,4,9 d换液.

1.4 电生理记录

将获取的大脑皮层神经细胞体外培养13,14 d后，对细胞进行电生理记录.采用全细胞膜片钳技术，在-70 mV的钳制电压下记录电流.记录mEPSC时，在细胞外液中加入100 μmol/L的GABA受体阻断剂PTX 和1 μmol/L的Na通道阻断剂TTX；记录mIPSC时，在细胞外液中加入10 μmol/L的AMPA受体阻断剂CNQX和1 μmol/L的Na通道阻断剂TTX[12,13].

1.5 数据处理

用Pclamp 10记录并导出数据后，再用Igor Pro Folder,GraphPad Prism进行处理分析.3次独立实验之后进行数据分析，用t检验进行差异分析，*表示显著性差异.

2 结果

2.1 细胞外Ca2+和细胞内Ca2+对大脑皮层神经细胞囊泡释放的影响

为研究神经元细胞外Ca2+和细胞内Ca2+对神经递质释放的影响，对体外培养成熟的神经元细胞进行电生理记录.实验分为3组，取大脑皮层细胞在正常外液、0 Ca外液、加入10 μmol/L BAPTA-AM的0 Ca外液中孵育30 min后，分别在上述3种外液中记录mEPSC,结果见图1.

A)在正常外液、0 Ca外液、加入10 μmol/L BAPTA-AM的0 Ca外液中孵育30 min后分别在正常外液、0 Ca外液、0 Ca外液中记录mEPSC；B)在正常外液、0 Ca外液、加入10 μmol/L BAPTA-AM的0 Ca外液中孵育30 min后分别在正常外液、0 Ca外液、0 Ca外液中记录mIPSC.**P<0.01 vs.

当外液中无Ca2+时，mEPSC频率降低；当外液中的Ca2+和细胞内的Ca2+同时不存在时，mEPSC频率进一步降低(见图1A)；同样的方法记录mIPSC时，发现在0 Ca外液中mIPSC的频率降低，进一步络合细胞内Ca2+后，mEPSC的频率稍微降低(见图1B).结果表明：去除细胞外Ca2+对神经细胞的囊泡释放有抑制作用(P<0.01)，同时去除细胞外Ca2+和细胞内Ca2+，对囊泡释放也有抑制作用.

2.2 细胞外Ca2+对大脑皮层神经细胞内可释放囊泡库的影响

取体外培养13 d的大脑皮层神经元细胞分别在加入TTX和PTX的正常外液和0 Ca外液中记录兴奋性突触可释放囊泡库大小，即在记录过程中给予所记录细胞30 s的0.5 mol/L 蔗糖溶液的刺激，在高渗溶液下，通过物理刺激将细胞中的囊泡都释放出来，引起电流变化，记录细胞的可释放囊泡库[14]，结果见图2.

A)正常外液、0 Ca外液中兴奋性突触可释放囊泡库大小；B)正常外液、0 Ca外液中抑制性突触可释放囊泡库大小.

在正常外液中和0 Ca外液中的可释放囊泡库无显著性差异(见图2A)；同等条件下，在加入TTX和CNQX的正常外液中和0 Ca外液中记录抑制性突触可释放囊泡库大小，同样无显著性差异(见图2B).因此，认为细胞外Ca2+对大脑皮层神经细胞内可释放囊泡库无影响.

2.3 细胞内Ca2+对大脑皮层神经元细胞内可释放囊泡库的影响

正常外液中加入DMSO，在0 Ca外液中加入10 μmol/L的BAPTA-AM，将体外培养成熟的大脑皮层神经元分别置于两组外液中孵育30 min，再分别在加入TTX和PTX的正常外液和0 Ca外液中记录细胞的兴奋性突触可释放囊泡库大小，结果见图3.加入BAPTA-AM络合细胞内Ca2+后，细胞内可释放囊泡库显著降低(P<0.01，见图3A)；相同条件下，改变两组外液中的阻断剂，加入TTX和CNQX，记录抑制性突触可释放囊泡库大小，发现在去除细胞内Ca2+之后的神经元内，可释放囊泡库较正常神经元的可释放囊泡库显著减小(P<0.001，见图3B).

A)分别在正常外液、加入10 μmol/L BAPTA-AM的0 Ca外液中孵育30 min后，在正常外液、0 Ca外液中记录兴奋性突触可释放囊泡库大小；B)分别在正常外液、加入10 μmol/L BAPTA-AM的0 Ca外液中孵育30 min后，在正常外液、0 Ca外液中记录抑制性突触可释放囊泡库大小.**P<0.01 vs.control ,***P<0.001 vs

因此，无论兴奋性还是抑制性突触，去除细胞内Ca2+，均能引起细胞内可释放囊泡库的减小，引起自发性囊泡释放的减少，即mEPSC和mIPSC频率的降低.故认为当同时去除细胞外Ca2+和细胞内Ca2+后，抑制自发性囊泡释放的原因是缺乏Ca2+引起囊泡膜与细胞膜融合和可释放囊泡库减小的综合结果.

3 讨论

在神经元囊泡释放的过程中，突触前膜对Ca2+的通透性增强，Ca2+内流，细胞内Ca2+浓度越高，对囊泡与突触前膜的融合作用越强，因此囊泡释放的频率越高.本实验中，当细胞外Ca2+浓度为0时，其囊泡释放的频率较正常细胞外Ca2+浓度下显著降低，而两种状况下的细胞内可释放囊泡库无显著变化.说明细胞外Ca2+仅仅参与囊泡释放的过程，对于囊泡释放前的反应并无太大的影响，频率降低的原因是当细胞外液无Ca2+时，细胞本身的游离内Ca2+浓度达不到促进囊泡释放的浓度，导致囊泡释放频率降低.

去除细胞外Ca2+并同时用BAPTA-AM络合细胞内Ca2+时，囊泡释放的频率较仅去除细胞外Ca2+时的频率进一步降低，本实验结果显示：去除细胞内Ca2+后，细胞内可释放囊泡库显著减小，因此囊泡释放频率的降低，除了无细胞Ca2+促进囊泡释放这一过程外，也受到可释放囊泡库减小这一因素的影响.

囊泡在成熟之前要经过不同的阶段，在神经元细胞里存在着发育到不同阶段的囊泡，而可释放囊泡库是由感应到细胞内Ca2+浓度变高时，就能迅速与突触前膜融合并释放出神经递质的囊泡组成.

当去除细胞内Ca2+，引起细胞内可释放囊泡库的减小，原因是细胞内Ca2+在囊泡产生及发育的过程中起重要作用，当细胞内Ca2+为0时，囊泡形成的某一阶段受影响，导致生成的囊泡数量减少.此外，还可能是细胞内Ca2+不会影响囊泡的形成，但在维持可释放囊泡库的过程中起至关重要的作用[15-17]，因此，当细胞内Ca2+为0时，可释放囊泡库里的囊泡不能正常储存，造成囊泡的流失，使可释放囊泡库减小；但细胞内Ca2+对神经元细胞的可释放囊泡库的减小的具体影响有待深入研究.