袁忠，胡俊，雷家维，付璐珩，俞曾强，汪海燕

(江西中医药大学附属洪都中医院，南昌330006)

Eag1对骨肉瘤细胞增殖、迁移与侵袭的影响及其机制

袁忠，胡俊，雷家维，付璐珩，俞曾强，汪海燕

(江西中医药大学附属洪都中医院，南昌330006)

目的 探讨Eag1对骨肉瘤细胞增殖、迁移与侵袭的影响及其机制。方法将骨肉瘤Saos-2细胞随机分为Eag1沉默组和对照组，分别转染Eag1 siRNA及scramble。分别采用荧光定量PCR法和Western blotting法检测两组Eag1 mRNA和蛋白相对表达量；MTT法检测两组培养24、48、72、96及120 h的细胞增殖能力(以OD值表示)，细胞划痕试验检测两组细胞迁移能力(以划痕愈合率表示)，Transwell侵袭试验检测两组细胞侵袭能力(以进入膜下的细胞数量表示)；采用Western blotting法检测两组STAT3蛋白相对表达量。结果Eag1沉默组与对照组Eag1 mRNA相对表达量分别为0.50±0.04、1.00±0.12，Eag1蛋白相对表达量分别为0.30±0.06、1.00±0.10，两组比较P均<0.05。Eag1沉默组接种24、48、72、96及120 h的OD值均低于对照组(P<0.05或<0.01)。Eag1沉默组和对照组划痕愈合率分别为42.34%±4.22%、95.12%±2.32%，进入膜下的细胞数量分别为(352±32)、(642±34)个，STAT3蛋白相对表达量分别为0.79±0.15、1.64±0.23，两组比较P<0.05或<0.01。结论Eag1沉默可抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移及侵袭；下调STAT3蛋白表达可能是其作用机制。

骨肉瘤；Eag1；STAT3；钾离子通道蛋白；细胞增殖；细胞侵袭；细胞迁移

骨肉瘤细胞起源于成骨细胞[1，2]，具有肿瘤细胞特征，可形成不成熟的骨或骨组织。骨肉瘤恶性程度较高，外科手术结合新辅助化疗的治疗效果较好，患者5年生存率可达75%，但40%～50%的患者会发展为难治性转移癌，预后较差[2]。近期研究表明，电压门控钾离子通道蛋白与骨肉瘤的发生密切相关，并有望成为骨肉瘤诊断和治疗的潜在靶点[3]。2015年1月～2016年1月，我们观察了一种新的电压门控钾离子通道蛋白Eag1对骨肉瘤细胞增殖、迁移与侵袭的影响，现分析结果并探讨其相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞：骨肉瘤Saos-2细胞购自南昌大学医学院实验中心。试剂：实验所需的一抗购自美国Santa Cruz公司，HRP标记的二抗购自英国Abcam公司，转染试剂Liposome 2000、TRIzol试剂均购自美国Invitrogen公司。Eag1 siRNA以及scrambles均由上海吉玛公司定制合成。

1.2 细胞分组处理 将对数生长期的Saos-2细胞随机分为Eag1沉默组和对照组，待细胞长满培养皿后利用Lipofectamine 2000分别转染Eag1 siRNA及scramble，严格按照转染试剂盒说明书操作。加入DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的恒温细胞培养箱中进行培养，用于以下试验。

1.3 细胞Eag1 mRNA表达检测 采用荧光定量PCR法。取对数生长期的两组细胞，待细胞长满培养皿后加入TRIzol试剂，提取总RNA。按照TaqMan RNA reverse transcription kit说明书，将5 ng总RNA逆转录合成cDNA。以cDNA为模板，在ABI 7500实时定量PCR仪中进行荧光定量PCR反应。引物序列：Eag1上游引物：5′-GCTTTTGAGAACGTGGATGAG-3′，下游引物：5′-CGAAGATGGTGGCATAGAGAA-3′；以β-actin为内参，上游引物：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物：3′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-5′。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 °C变性5 s，60 °C退火34 s，40个循环。以2-ΔΔCt法计算Eag1 mRNA相对表达量。

1.4 细胞Eag1蛋白表达检测 采用Western blotting法。取对数生长期的两组细胞，待细胞长满培养皿后加入裂解液，提取细胞总蛋白，浓缩胶80 V电泳40 min，分离胶100 V电泳2 h。常规湿法转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h；分别加入Eag1和GAPDH一抗(1∶200)孵育过夜，加入二抗(1∶1 000)孵育2 h，ECL法化学发光。采用Quantity One 1-D软件对蛋白质印迹条带进行定量分析，以Eag1与GAPDH灰度值的比值表示其相对表达量。

1.5 Eag1对Saos-2细胞增殖、迁移与侵袭影响的观察

1.5.1 细胞增殖能力 采用MTT法。取对数生长期的两组细胞，以2×103个/孔接种于96孔板。分别于接种24、48、72、96及120 h，每孔加入5 mg/mL MTT溶液40 μL。孵育4 h后每孔加入200 μL二甲基亚砜(DMSO)，置于摇床上充分震荡。采用酶标仪测定两组各时间点570 nm处的光密度值(OD值)。每组设置6个复孔，取平均值。

1.5.2 细胞迁移能力 采用细胞划痕试验。取对数生长期的两组细胞，以2×104个/孔接种于6孔板。细胞融合后，采用灭菌枪头沿直线用力划。分别于划痕后即刻、48 h在显微镜下观察划痕修复情况，计算划痕愈合率。划痕愈合率=(划痕后即刻面积-划痕后48 h面积)/划痕后即刻面积×100%。试验重复3次，取平均值。划痕愈合率越高，表示细胞迁移能力越强。

1.5.3 细胞侵袭能力 采用Transwell侵袭试验。将两组细胞培养24 h后，取2×104个接种于Transwell小室的碳酸磷脂表面，上室 BioCoatTM包被Matrigel基质胶，37 ℃培养24 h。取出上层小室，将膜下面的侵袭细胞与1%多聚甲醛混合，0.2%结晶紫溶液染色15 min。于200倍显微镜下随机取10个视野，计数进入膜下的细胞数量，取平均值。试验重复3次。

1.6 细胞STAT3蛋白表达检测 参照1.4的方法，采用Western blotting法检测两组细胞STAT3蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 两组Eag1 mRNA和蛋白相对表达量比较 Eag1沉默组Eag1 mRNA相对表达量为0.50±0.04，对照组为1.00±0.12，两组比较P<0.05。Eag1沉默组Eag1蛋白相对表达量为0.30±0.06，对照组为1.00±0.10，两组比较P<0.05。

2.2 两组细胞增殖能力比较 见表1。

表1 两组各时间点细胞增殖能力比较

注：与对照组同时间点比较，*P<0.05，#P<0.01。

2.3 两组细胞迁移能力比较 Eag1沉默组划痕愈合率为42.34%±4.22%，对照组为95.12%±2.32%，两组比较P<0.05。

2.4 两组细胞侵袭能力比较 Eag1沉默组进入膜下的细胞数量为(352±32)个，对照组为(642±34)个，两组比较P<0.01。

2.5 两组STAT3蛋白表达比较 Eag1沉默组STAT3蛋白相对表达量为0.79±0.15，对照组为1.64±0.23，两组比较P<0.05。

3 讨论

骨肉瘤好发于长骨端，局部肿痛、跛行为其常见临床表现，软组织肿块、骨皮质增生及特征性的Codmans三角为其常见影像学特征[4]。骨肉瘤组织镜下可见肿瘤细胞呈高度异型性，以梭形或多边形为主，大小形态不一，可见病理性核分裂相。肿瘤分期、转移或复发、化疗、解剖部位、肿瘤大小都可以影响骨肉瘤患者的预后[5]。研究报道，30岁以下的骨肉瘤患者5年生存率达60%，30～49岁患者为50%，而50岁以上者仅为30%[6]。现代肿瘤学认为，肿瘤的发生是一系列基因(p53、p21等)表达发生异常改变的结果，而骨肉瘤的发生、发展机制目前仍不清楚。

近年来，钾离子通道蛋白成为肿瘤生物学的研究热点[7]。一些钾离子通道蛋白，特别是Eag1与肿瘤生长、进展和转移关系密切。Eag基因于1969年克隆自黑腹果蝇[8]，由三个亚科形成：Eag、Erg (Eag相关基因)和Elk(Eag类似基因)，其中Eag的两个成员分别是Eag1和Eag2[9]。正常生理状况下，Eag1基因表达往往仅限于大脑组织；但部分肿瘤组织中Eag1却出现异常高表达[10]。因此Eag1可能是一个潜在的肿瘤标志物。Liu等[11]报道，Eag1表达与乳腺癌的肿瘤直径、TNM分期、淋巴结转移等恶性生物学特征相关。Eag1高表达与急性白血病、卵巢癌、结肠癌和食管癌预后差相关[12，13]，尽管已有研究证明Eag1在骨肉瘤组织中异常表达[14]，但其是否与骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学行为有关却依然未有定论。本研究结果显示，Eag1沉默组Eag1 mRNA及其蛋白相对表达量均明显低于对照组，表明Eag1沉默组Eag1基因沉默成功。Eag1沉默组接种24、48、72、96及120 h的OD值均低于对照组，说明Eag1沉默可抑制骨肉瘤细胞的增殖；Eag1沉默组划痕愈合率和进入膜下的细胞数量均低于对照组，说明Eag1沉默可抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭。研究表明，Eag1可促进乳腺癌细胞的迁移[15]。本研究与上述报道结论一致。

STAT3蛋白与多种肿瘤的发生、发展相关，其中也包括骨肉瘤[16]。本研究结果显示，Eag1沉默组STAT3蛋白相对表达量明显低于对照组，说明Eag1基因沉默可下调STAT3蛋白表达。研究表明，沉默STAT3可调控血管生长因子的表达，而血管生长因子与骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭密切相关[17]。因此，我们推测沉默Eag1可能通过下调STAT3而调控血管生长因子表达，从而发挥抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的生物学效应，但其具体机制仍需进一步研究。

综上所述，Eag1沉默可抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移及侵袭，下调STAT3蛋白表达可能是其作用机制。本研究为进一步研究骨肉瘤的发病机制提供了新的思路，Eag1有望成为骨肉瘤诊断的一种潜在的生物标记物，其是否可以成为骨肉瘤治疗的新靶点仍需深入探讨。

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2016-03-27)