丁谨，刘芳，胡彩艳，施继禹

(青海大学医学院，西宁810010)

红系细胞发育相关miR-196b的靶基因预测及意义

丁谨，刘芳，胡彩艳，施继禹

(青海大学医学院，西宁810010)

目的 预测红系细胞发育相关miR-196b的靶基因，并探讨其作用机制。方法应用miRbase数据库查找多物种已知的miR-196b成熟序列，比对后分析其在多物种间的保守性。应用miRanda、miRDB、Targetscan7.1、PITA和miRWalk数据库对miR-196b的靶基因进行预测，筛选重复率较高的靶基因。应用Cytoscape3.3.0和KEGG对重复率较高的靶基因进行GO分类富集分析和信号通路富集分析。查阅文献，再次筛选与红系细胞发育相关的靶基因，采用Targetscan7.1和RNA22分析其与miR-196b的结合情况。结果22个物种具有miR-196b成熟序列，序列比对发现miR-196b在多物种间高度保守。靶基因预测结果显示，共得到5 004个miR-196b的靶基因，其中重复率较高的靶基因有302个。GO分类富集分析结果显示，miR-196b靶基因在生物学过程显著富集于发育过程、细胞过程和定位等，在分子功能显著富集于蛋白结合和物质转运等，在细胞组分显著富集于细胞突起和细胞器膜等(P均<0.05)。结合信号通路富集分析结果，筛选出43个与红系细胞发育相关miR-196b的靶基因，其信号通路富集于Ras信号通路、cAMP信号通路和PI3K-Akt信号通路等(P均<0.05)。结合文献，最终筛选出与红系细胞发育相关的miR-196b靶基因有5个，分别为GATA1、Cdkn1b、Pld1、Cdh1和Ntrk2，其中GATA1、Cdkn1b和Cdh1可与miR-196b直接结合。结论红系细胞发育相关miR-196b的靶基因可能为GATA1、Cdkn1b、Pld1、Cdh1和Ntrk2；miR-196b可能通过对上述靶基因的直接或间接作用激活相应信号通路，在红系细胞的发育过程中发挥生物学作用。

红系细胞；miR-196b；靶基因；生物信息学

微小RNA(miRNAs)是一种约有22个核苷酸的内源性非编码小RNA，通过与靶mRNA的不完全性互补配对，在转录后水平调控基因表达，参与生命体发生、发展和死亡的生物学过程[1]。miR-196家族通过对其靶基因的调控，在机体正常发育和肿瘤发生中发挥重要作用[2]。miR-196b在不同的细胞中表达不同，靶基因和生物学作用也不同[3～5]。近年来，关于miR-196b在肿瘤发生、发展中的作用研究较多，但其在红系细胞(简称红系)发育中的作用尚未被证实。2016年3～6月，本研究通过在线工具预测红系发育相关miR-196b的靶基因，为研究其在红系发育中的作用提供依据。

1 材料、方法与结果

1.1 材料 数据库及在线工具：miRbase(https://www.mirbase.org/)、miRanda(http://www.microrna.org/microrna/home.do)、miRDB(http://www.mirdb.org/miRDB/)、Targetscan7.1(http://www.targetscan.org/vert_71/)、PITA(http://www.pita.ps/)、miRWalk(http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/index.html)[6～8]、KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)、RNA22(https://cm.jefferson.edu/rna22/)。Cytoscape 3.3.0软件从http://www.cytoscape.org/index.html官方网站下载。

1.2 红系发育相关miR-196b的靶基因预测

1.2.1 序列保守性分析 应用miRbase数据库查找多物种已知的miR-196b成熟序列，进行序列比对，查找高度相似序列(在不同物种中非常相似的DNA序列)，分析其在多物种间的保守性。结果显示，有22个物种具有miR-196b成熟序列，序列比对发现miR-196b序列在22个物种中相似度极高，高度相似序列为“-uagguaguuuuauguuguugg-”，表明miR-196b在多物种间高度保守。

1.2.2 靶基因预测 应用miRanda、 miRDB、Targetscan7.1、PITA和miRWalk数据库对miR-196b的靶基因进行预测，共得到5 004个miR-196b的靶基因。筛选重复率较高的靶基因，其中在3个及以上数据库中出现的靶基因有302个。

1.2.3 GO分类富集分析 应用Cytoscape3.3.0软件中的BINGO插件对1.2.2中重复率较高的302个miR-196b靶基因进行GO生物学过程、分子功能和细胞组分的富集分析，共得到202个靶基因的生物学过程注释信息、212个靶基因的分子功能注释信息、218个靶基因的细胞组分注释信息。GO分类富集结果采用超几何分布检验，P<0.05为差异有统计学意义。结果显示，miR-196b靶基因在生物学过程显著富集于发育过程、细胞过程和定位等(P均<0.05)，见表1；在分子功能显著富集于蛋白结合和物质转运等(P均<0.05)，见表2；在细胞组分显著富集于细胞突起和细胞器膜等(P均<0.05)，见表3。

表1 miR-196b靶基因的GO生物学过程分析结果

1.2.4 信号通路富集分析 应用KEGG对302个靶基因进行信号通路分析，从中筛选出29个与红系发育相关的miR-196b靶基因，包括Calm1、Cdkn1b、Grin1、Cyp7a1、Il13ra1、Ibsp、Acsl4、Pld1、Smad9、Il2rg、Rasgrp1、Ralbp1、Gnai2、Cdc25a、Cftr、Ets1、Gabbr2、 Npy1r、 Pdgfra、 Ccng1、 Cdh1、 Ctsb、 Itgb6、Tbl1x、Gabarap、Nras、Pla2g2d、Capn1、Ntrk2。GO分类富集分析筛选出与红系发育相关miR-196b的靶基因有17个：DGKG、CLIC5、NTRK2、UBE2B、LHFPL5、LRP4、ACSL4、GATA1、DCLK1、GAP43、CNP1、CDH1、MAP1B、NRCAM、NCDN、APBB1、GAS7。取上述靶基因的合集，共得到43个与红系发育相关的miR-196b靶基因。对43个靶基因进行信号通路富集分析，结果比较采用Fisher精确检验，P<0.05为差异有统计学意义。结果显示，红系发育相关miR-196b的靶基因信号通路富集于Ras信号通路、cAMP信号通路和PI3K-Akt信号通路等(P均<0.05)，见表4。

表2 miR-196b靶基因的GO分子功能分析结果

表3 miR-196b靶基因的GO细胞组分分析结果

表4 红系发育相关miR-196b靶基因的信号通路富集分析结果

1.3 靶基因筛选 查阅文献，结合miR-196b靶基因的GO分类富集分析和KEGG信号通路富集分析结果，再次筛选与红系发育相关miR-196b的靶基因，结果显示其靶基因为GATA1、Cdkn1b、Pld1、Cdh1和Ntrk2[9～13]。采用Targetscan7.1、RNA22对miR-196b和上述5个基因进行序列匹配分析。结果显示，GATA1、Cdkn1b和Cdh1可与miR-196b直接结合。

2 讨论

miRNAs可影响多种生物学过程，如细胞增殖、分化和凋亡，激素分泌，多种器官正常发育等，并与人类多种疾病的发生、发展密切相关。miR-196b定位于同源区域(HOX)基因簇内，迄今为止已有诸多研究探讨其作用。研究发现，在胃癌中miR-196b与HOXA10(同源基因A10)的表达及不良预后呈正相关，亦有研究证实miR-196b能促进胃癌细胞的侵袭和迁移[14]；Rebucci等[15]证实，原发性肝癌组织过表达miR-196b，生长因子2结合蛋白1(IGF2BP1)表达被抑制，细胞增殖率也明显降低。在胃癌发病中，miR-196b可通过调节PI3K/Akt/mTOR通路促进癌细胞增殖[16]；在结肠癌发病中，miR-196b可通过抑制Fas表达而抑制细胞凋亡[3]；在慢性粒细胞白血病发病中，miR-196b可抑制BCR-ABL1和HOXA9表达，降低细胞增殖率，并延缓细胞周期[17]。由此可见，miR-196b在细胞增殖、分化与凋亡的生物学过程中发挥重要调控作用。采用生物信息学方法预测miRNAs的靶基因并分析其相互作用，对研究miRNAs的生物学作用具有重要指导意义。

本研究首先分析了miR-196b的保守性，提示miR-196b与生物体的基础生命功能密切相关。其次，采用生物信息学方法预测得到302个重复率较高的靶基因，对上述靶基因进行功能富集分析，结果发现其主要富集于发育过程、细胞过程等。信号通路富集分析结果显示，miR-196b靶基因富集于Ras信号通路、cAMP信号通路和PI3K-Akt信号通路等。既往研究表明，红系特异转录因子1能抑制MEK活性，进而阻抑Ras信号通路，促进红细胞生成[18]。cAMP信号通路可诱导γ-球蛋白基因表达、抑制c-myb蛋白表达，从而促进造血干细胞向红系分化。在红系祖细胞中，促红细胞生成素(EPO)可以激活PI3K-Akt信号通路，促进cyclin D3、E和A表达，从而促进红细胞生成。以上说明Ras、cAMP和PI3K-Akt信号通路均参与了红系的正常发育过程。结合本研究预测结果，说明miR-196b可能通过与靶基因的相互作用参与Ras、cAMP和PI3K-Akt信号通路的调控，从而在红系发育过程中发挥重要作用。

本研究通过进一步查阅文献，筛选出与红系发育相关miR-196b的靶基因有GATA1、Cdkn1b、Pld1、Cdh1和Ntrk2；序列匹配分析结果表明，GATA1、Cdkn1b和Cdh1可能受miR-196b的直接调控，而Pld1和Ntrk2可能受miR-196b的间接调控。研究表明，GATA1可以通过招募其他辅助因子, 调控下游红系特异性靶基因的表达, 保障红细胞分化的顺利进行[19]。Cdkn1b可抑制CDK2，使终末分化的幼红细胞退出细胞周期，从而形成成熟的红细胞[12]。Cdh1是EPO的下游靶基因，在早期CD34+祖细胞中，EPO诱导Cdh1表达，从而促进造血祖细胞向红系分化[14]。以上均提示，miR-196b可能通过对GATA1等下游靶基因的直接或间接作用调控红系的发育过程。

综上所述，与红系发育相关miR-196b的靶基因可能是GATA1、Cdkn1b、Pld1、Cdh1和Ntrk2；miR-196b可能通过对上述靶基因的直接或间接作用激活相应信号通路，在红系的发育过程中发挥生物学作用。本研究为后期验证miR-196b及其下游靶基因在红系发育过程中的生物学作用提供了一定依据。

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Target gene prediction of erythroid cells-related miR-196b

DingJin,LIUFang,HUCaiyan,SHIJiyu

(MedicalCollegeofQinghaiUniversity,Xining810010,China)

Objective To predict the target genes of miR-196b related to erythroid cells and to explore their mechanism. Methods We applied miRbase database to search for miR-196b mature sequence of multiple species and analyze its conservation. MiRanda, miRDB, Targetscan7.1, PITA and miRWalk databases were used to predict the target genes of miR-196b, and we screened the target genes with high repetition rate. GO annotation and signal pathway enrichment analysis on target genes with high repetition rate were performed using Cytoscape3.3.0 and KEGG. Combined with literature, the target genes related to erythroid cells were screened out, and we applied Targetscan7.1 and RNA22 to analysis their combination with miR-196b. Results Twenty-two species had miR-196b mature sequence, and we found that miR-196b was highly conserved among different species by sequence alignment. Target gene prediction results showed that a total of 5 004 miR-196b target genes were chosen, of which 302 target genes had a high repetition rate. GO enrichment analysis showed that the target genes of miR-196 in biological process were significantly enriched in the developmental process, cellular process and localization; as for the molecular function, they were significantly enriched in protein binding and material transport, and as for the cell component, they were significantly enriched in cell projection and organelle membrane (allP<0.05). Signal pathway enrichment analysis showed that 43 target genes-associated with cell development were screened out, and their signal pathways were enriched in Ras signaling pathway, cAMP signaling pathway and PI3K-Akt signaling pathway (P<0.05). Finally, 5 target genes were screened out, which were Ntrk2, Cdkn1b, Pld1, Cdh1 and GATA1, in which Cdh1, Cdkn1b and GATA1 could be directly combined with miR-196b. Conclusions The erythroid cells-related miR-196b target genes may be GATA1, Cdkn1b, Pld1, Cdh1 and Ntrk2. Meanwhile, miR-196b can activate the corresponding signaling pathway through the direct or indirect effect of the target genes, and plays a biological role in the development of erythroid cells.

erythroid cells; miR-196b; target genes; bioinformatics

国家自然科学基金资助项目(81441116)；青海省科技厅(应用)基础研究计划项目(2012-Z-729)；青海大学“123高层次人才培养工程”-中青年学术带头人基金资助项目；青海大学医学院中青年科研基金团队项目(2014-KT-1)。

丁谨(1992-)，女，硕士在读，研究方向为慢性高原病的发病机制。E-mail： jin11146@163.com

刘芳(1972-)，女，教授，研究方向为慢性高原病的发病机制。E-mail： qhxnlf2006@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.48.004

R555.1

A

1002-266X(2016)48-0012-04

2016-07-21)