姚菲菲，孙立秋，方伟，王化民，姚东升，崔蕊，徐佳，王莉，王秀梅

(哈尔滨医科大学第四附属医院，哈尔滨150001)

miR-214在狼疮性肾炎小鼠肾小球系膜细胞增殖中的作用及其机制

姚菲菲，孙立秋，方伟，王化民，姚东升，崔蕊，徐佳，王莉，王秀梅

(哈尔滨医科大学第四附属医院，哈尔滨150001)

目的 探讨微小RNA-214(miR-214)在狼疮性肾炎(LN)小鼠肾小球系膜细胞增殖中的作用及其相关机制。方法将MRL-Faslpr/JNju小鼠(简称LN小鼠，20只)和野生型小鼠(20只)处死，分离、培养其肾小球系膜细胞；将LN小鼠肾小球系膜细胞随机分为两组，分别转染miR-214 mimics(观察组)和NC mimics control(对照组)。采用实时荧光定量PCR法检测两种小鼠及两组肾小球系膜细胞miR-214相对表达量，采用MTT法检测两组转染1、2、3天的细胞增殖抑制率。采用生物信息学方法预测细胞中miR-214的靶基因，并经双荧光素酶报告基因试验验证，YKL-40是miR-214的靶基因。采用实时荧光定量PCR法和Western blotting法检测两组YKL-40 mRNA及蛋白相对表达量。取对数生长期的LN小鼠肾小球系膜细胞，分别转染siYKL-40和negative control，采用MTT法检测转染1、2、3天的细胞增殖抑制率。结果LN小鼠和野生型小鼠肾小球系膜细胞miR-214相对表达量分别为0.35±0.09、1，两者比较P<0.01。观察组和对照组miR-214相对表达量分别为85.54±12.07、1，两组比较P<0.01。观察组转染1、2、3天的细胞增殖抑制率均高于对照组(P<0.05或<0.01)。与对照组比较，观察组YKL-40 mRNA及蛋白相对表达量均降低(P均<0.05)。与转染negative control比较，转染siYKL-40的LN小鼠肾小球系膜细胞转染1、2、3天的细胞增殖抑制率均升高(P<0.05或<0.01)。结论LN小鼠肾小球系膜细胞中miR-214表达降低，上调miR-214表达可抑制其增殖；下调YKL-40表达可能是miR-214的作用机制。

狼疮性肾炎；微小RNA-214；肾小球系膜细胞；细胞增殖；YKL-40；小鼠

肾小球系膜细胞过度增殖是狼疮性肾炎(LN)的主要病变特点，过度增殖的系膜细胞可以释放更多的炎症因子，分泌细胞外基质，加剧炎症和引起肾小球硬化。微小RNA分子(microRNAs)简称miRNAs，广泛参与胚胎发育、细胞分化、肿瘤形成及损伤修复等生理病理过程[1,2]。研究发现，LN组织中有36个miRNAs 表达上调、30个 miRNAs表达下调，关于miR-214 在LN发生、发展中的作用报道较少[3]。2014年1月，我们观察了miR-214对LN小鼠肾小球系膜细胞增殖能力的影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 ①动物：10周龄MRL-Faslpr/JNju小鼠(简称LN小鼠)20只，体质量(24.5±2.6)g；10周龄野生型小鼠20只，体质量(22.3±1.8)g；均为SPF级，由南京大学动物模式研究所提供。②试剂：总RNA提取试剂(TRIzol试剂)、DMEM培养基及胎牛血清均购于美国Invitrogen公司，反转录试剂盒 (TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit)、SYBR premix Ex TaqTMⅡ PCR Kit均购于日本TaKaRa公司，miR-214 mimics(5′-UCAUGUGUCUGCCUGUCUACACUU-3′)及YKL-40 siRNA(5′-CCAGAUGCCCUUGACCGCUUCCUCU-3′)均购于上海吉凯基因化学技术有限公司，鼠YKL-40(ab86428)单克隆抗体购于英国Abcam公司，双荧光素酶检测试剂盒购于美国Promega公司。

1.2 肾小球系膜细胞miR-214表达检测 采用实时荧光定量PCR法。将LN小鼠和野生型小鼠处死，参照Costa-Reis等[4]的方法分离、培养肾小球系膜细胞，并予以鉴定。取培养3～6代对数期生长的肾小球系膜细胞，加入TRIzol试剂提取总RNA，逆转录合成cDNA。在LightCycler480Ⅱ荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR反应，严格按照SYBR premix Ex TaqTMⅡ PCR Kit试剂盒说明书操作。miR-214上游引物 5′-TGGCTGGACAGAGTTGTCATGTGT -3′，下游引物为日本TaKaRa公司试剂盒提供的通用引物；以U6作为内参，上游引物5′-GCACCATGCTCTTCTACTCCTTT-3′，下游引物5′-TGACACTGATGTCGGTTAGTTTGATA-3′。反应体系：模版cDNA 1 μL，miR-214特异性引物 0.4 μL，10×miScript Universal Primer 2 μL，2×SYBR premix Ex TaqTMⅡ PCR 10 μL，加RNase-free water至反应总体积为20 μL。PCR反应条件：95 ℃ 30 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，共45个循环。以2-ΔΔCT法[5]计算miR-214相对表达量。

1.3 miR-214对LN小鼠肾小球系膜细胞增殖的影响

1.3.1 miR-214 mimics转染 取培养3～6代对数期生长的LN小鼠肾小球系膜细胞，按2×105个/孔接种于6孔板中，待细胞贴壁且细胞融合至50%～70%时换为无血清无双抗培养基。将LN小鼠肾小球系膜细胞随机分为两组，分别转染miR-214 mimics(观察组)和NC mimics control(对照组)，严格按照 lipofectamine 2000转染试剂说明书操作。培养6 h后，换为有血清的细胞培养基，继续培养48 h，参照1.2的方法检测miR-214相对表达量。

1.3.2 细胞增殖抑制率检测 采用MTT法。将1.3.1中分别转染miR-214 mimics和NC mimics control的两组细胞接种于96 孔板，每孔细胞数为8 000～9 000个，每孔设置3个复孔。当细胞融合至75%左右时，每孔加入 16 μL MTT(5 g/L)作用4 h，弃去上清，加入130 μL二甲亚砜(DMSO)进行溶解，以450 nm波长时的光密度值(OD值)计算细胞增殖抑制率，取平均值。连续检测3天。

1.4 miR-214的靶基因预测及验证

1.4.1 靶基因生物信息学预测 采用TargetScan(http://www.targetscan.org/)、miRanda(http://www. targetscan.org/)和PicTar(http://pictar.mdc-berlin. de/)等生物信息学数据库预测miR-214的靶基因，结果提示YKL-40是其靶基因。

1.4.2 靶基因验证 采用双荧光素酶报告基因试验。方法如下：①构建靶基因荧光素酶报告基因：参照1.2的方法，分离、培养LN小鼠肾小球系膜细胞，提取总RNA，以反转录合成的cDNA作为模板，按以下引物扩增靶基因YKL-40的3′-UTR区域。上游引物：5′-CCGCTCGAGCCCTCTGTTCTGCACACAGCACGGG-3′(XhoⅠ)，下游引物： 5′-AAGGAAA-AAAGCGGCCGCAATAAAGTACAAGAGCTTAACAG-TG-3′(NotⅠ)。PCR扩增产物使用XhoⅠ+NotⅠ双酶切后，接入同样经过XhoⅠ+NotⅠ双酶切的双荧光素酶报告载体psiCHECK2中，将连接好的重组质粒转化大肠杆菌感受态，采用PCR法鉴定菌落。将含有目的片段的菌落进行摇菌，按照质粒提取试剂盒方法提取质粒，将提取好的质粒送上海生工生物工程有限公司进行序列验证。YKL-40 mRNA 3′-UTR结合miR-214的互补序列进行GGACGAC到UUGAUGA点突变，此序列由上海生工生物工程有限公司制备，并经测序验证。②双荧光素酶报告基因验证：将1.3.1中分别转染miR-214 mimics和NC mimics control的两组细胞接种于24孔板，每孔细胞数为4×104个。当细胞融合至75%左右时，分别转染psiCHECK2-YKL-40-3′-UTR-WT(野生型)、psiCHECK2-YKL-40-3′-UTR-MUT(突变型)，严格按照lipofectamine 2000转染试剂说明书操作。转染6 h后换液，24 h后裂解细胞，分别检测萤火虫及海肾荧光素酶的荧光强度，计算相对荧光素酶活性。结果证实YKL-40为miR-214的靶基因，miR-214与YKL-40 mRNA 3′-UTR结合区域预测为GGACGAC。观察组野生型和突变型相对荧光素酶活性分别为40.21%±3.37%、1，对照组分别为98.72%±5.64%、1；观察组野生型和突变型比较P<0.05。

1.5 miR-214对LN小鼠肾小球系膜细胞YKL-40表达的影响

1.5.1 miR-214对LN小鼠肾小球系膜细胞YKL-40 mRNA表达的影响 采用实时荧光定量PCR法。取1.3.1中分别转染miR-214 mimics和NC mimics control的两组细胞，以GAPDH为内参，参照1.2的方法检测YKL-40 mRNA相对表达量。

1.5.2 miR-214对LN小鼠肾小球系膜细胞YKL-40蛋白表达的影响 采用Western blotting法。取1.3.1中分别转染miR-214 mimics和NC mimics control的两组细胞，加入10 μL RIPA裂解液，10 min后提取总蛋白，并测定蛋白浓度。将提取好的蛋白采用BCA定量试剂盒定量到5 μg/μL，按比例加入5×SDS上样缓冲液，105 ℃加热15 min。制备SDS聚丙烯酰胺凝胶，每孔上样量为20 μL，常规电泳、转膜、封闭。加入抗YKL-40抗体(ab86428，1∶1 000)，4 ℃孵育过夜；加入相应的二抗(1∶10 000)，室温孵育1 h。TBST洗涤3次，ECL发光液处理后暗室内曝光胶片，于室温下自然风干，扫描仪扫描结果。以目的蛋白与内参蛋白灰度值的比值作为YKL-40蛋白相对表达量。

1.6 YKL-40对LN小鼠肾小球系膜细胞增殖的影响 取培养3～6代对数生长期的LN小鼠肾小球系膜细胞，按2×105个/孔接种于6孔板中，待细胞贴壁且细胞融合为50%～70%时换为无血清无双抗培养基。参照1.3.1的方法分别转染siYKL-40和negative control，采用MTT法检测转染1、2、3天的细胞增殖抑制率。

2 结果

2.1 肾小球系膜细胞miR-214表达 LN小鼠和野生型小鼠肾小球系膜细胞miR-214相对表达量分别为0.35±0.09、1，两者比较P<0.01。观察组和对照组miR-214相对表达量分别为85.54±12.07、1，两组比较P<0.01。

2.2 两组细胞增殖抑制率比较 见表1。

表1 两组细胞增殖抑制率比较

注：与对照组同时间点比较，*P<0.05，#P<0.01。

2.3 两组YKL-40 mRNA及蛋白相对表达量比较 观察组和对照组YKL-40 mRNA相对表达量分别为0.37±0.09、1，YKL-40蛋白相对表达量分别为0.21±0.07、1，两组比较P均<0.05。

2.4 YKL-40对LN小鼠肾小球系膜细胞增殖的影响 见表2。

表2 转染siYKL-40和negative control的LN小鼠肾小球系膜细胞增殖抑制率比较

注：与转染negative control的LN小鼠肾小球系膜细胞比较，*P<0.05，#P<0.01。

3 讨论

miRNAs主要与靶基因mRNA的3′-UTR 区域结合，通过降解或转录后抑制或减少靶基因蛋白的形成。自1993年miRNAs家族成员lin-4和let-7被发现以来，临床上通过分子克隆及生物信息学方法至今已经发现了9 000多种miRNAs，人类基因组编码了超过1 000个miRNAs[6]。miR-214属于miRNAs家属成员之一，关于miR-214的研究主要集中在肿瘤诊断与治疗方面。如miR-214在结肠癌和膀胱癌中表达明显降低，并可作为肿瘤转移的重要标志物[7,8]。miR-214可以通过下调p53基因表达而显著抑制乳腺癌的侵袭与转移[9]，还可作为抑癌基因调控食管癌的发生、发展[10]。本研究结果显示，LN小鼠肾小球系膜细胞miR-214相对表达量明显低于野生型小鼠，表明miR-214表达降低与LN的发生有关；而转染miR-214 mimics的观察组miR-214表达明显升高，且可以明显抑制肾小球系膜细胞增殖，并呈时间依赖性，表明过表达miR-214可显著抑制LN小鼠肾小球系膜细胞增殖。

本研究进一步发现YKL-40为miR-214的靶基因，获取了YKL-40 mRNA 的3′-UTR序列，通过生物信息学方法分析发现YKL-40 3′-UTR存在miR-214的保守结合位点；双荧光素酶报告基因试验显示，miR-214可降低野生型报告基因的相对荧光素酶活性，而对突变型报告基因的相对荧光素酶活性无影响。本研究结果显示，观察组YKL-40 mRNA及蛋白表达均明显低于对照组，说明上调miR-214表达可明显抑制YKL-40表达水平。上述结果提示，miR-214以完全配对的方式结合YKL-40 mRNA 的3′-UTR序列，且miR-214对靶基因YKL-40的表达具有重要的调控效应。

YKL-40是一种细胞因子，可参与多种免疫性疾病的发生与发展，如选择性IgA缺乏症、慢性淋巴细胞性白血病及淋巴瘤等[11,12]。研究发现，干扰YKL-40表达可延缓慢性淋巴细胞性白血病的进展[13]。最新研究发现，YKL-40在正常肾组织中表达降低，并具有抑制肾小球系膜细胞增殖的作用[14]。本研究结果显示，转染siYKL-40的LN小鼠肾小球系膜细胞增殖抑制率明显高于转染negative control的细胞；说明干扰YKL-40表达同样可降低LN小鼠肾小球系膜细胞的增殖，其作用与过表达miR-214一致。以上结果提示，miR-214可能通过介导YKL-40而调控肾小球系膜细胞的增殖，进而参与LN的发生与发展。

综上所述，LN小鼠肾小球系膜细胞miR-214表达降低，其可能通过下调YKL-40表达而抑制细胞增殖。miR-214有望成为LN诊断和治疗的新分子标志物，亦可能作为LN基因治疗的一个有效靶点，但是其具体的作用机制还有待于进一步研究。

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Effect of microRNA-214 on proliferation of mouse mesangial cells with lupus nephritis

YAOFeifei,SUNLiqiu,FANGWei,WANGHuamin,YAODongsheng,CUIRui,XUJia,WANGLi,WANGXiumei

(FourthHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China)

Objective To investigate the effect and molecular mechanism of microRNA-214 (miR-214) on the proliferation of mouse mesangial cells with lupus nephritis (LN). Methods The MRL-Faslpr/JNju mice (LN mice,n=20) and wild-type mice (n=20) were sacrificed and the glomerular mesangial cells were isolated and cultured. The relative expression of miR-214 was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. The glomerular mesangial cells in the logarithmic phase were randomly divided into two groups, which were separately transfected by MiR-214 mimics (observation group) and NC mimics control (control group). The inhibitory rate of proliferation of mouse mesangial cells was detected by MTT. The target gene of miR-214 was predicted by bioinformatics analysis and verified by dual luciferase reporter assay. Furthermore, the mRNA and protein expression levels of YKL-40 were examined by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting. LN mouse mesangial cells in the logarithmic phase were selected and then were transfected with siYKL-40 and negative control, respectively, and the inhibitory rate of cell proliferation was detected by MTT assay. Results The expression of miR-214 in the mouse mesangial cells of LN group was 0.35±0.09, which was significantly down-regulated as compared with that of the control group (1) (P<0.01). The expression of miR-214 in the miR-214 mimics group and NC mimics control group was 85.54±12.07 and 1 (P<0.01). The inhibitory rate of proliferation in the observation group was higher than that of the control group on day 1, 2 and 3 (P<0.05 orP<0.01). Compared with the control group, the relative expression of YKL-40 mRNA and protein decreased in the observation group (allP<0.05). Compared with that transfected with negative control, the proliferation inhibition rate of glomerular mesangial cells in the LN mice transfected with siYKL-40 increased (P<0.05 orP<0.01). Conclusions The expression of miR-214 is down-regulated in LN mouse mesangial cells. Up-regulation of miR-214 expression inhibits the proliferation of mouse mesangial cells, which may be mediated by YKL-40 down-regulation.

lupus nephritis; microRNA-214; mesangial cells; proliferation; YKL-40; mice

黑龙江省青年科学基金资助项目(QC2010094)。

姚菲菲(1980-)，女，主治医师，研究方向为肾脏病学基础与临床。E-mail： yaofeifeidoctor@sina.com

王秀梅(1962-)，女，副主任医师，研究方向为肾脏病学基础与临床。E-mail： wxmhaerbing2010@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.48.005

R593.2424

A

1002-266X(2016)48-0016-04

2015-12-24)