王晓东

汉黄芩素对人肝癌SMMC-7721的抑制作用及其作用机制研究

王晓东

目的研究汉黄芩素对SMMC-7721细胞的抑制及其作用机制。方法MTT法检测细胞的增殖抑制率，Western-blot检测细胞凋亡通路中关键蛋白Pro-caspase-9和Pro-caspase-8的表达水平。结果汉黄芩素能抑制人肝癌SMMC-7721细胞的增殖，作用癌细胞后，Procaspase-9蛋白的表达水平明显降低，Pro-caspase-8的表达水平无明显变化。结论汉黄芩素能够抑制SMMC-7721细胞增殖，汉黄芩素通过线粒体信号通路促进人肝癌SMMC-7721细胞的凋亡，汉黄芩素作为抗肝癌药物具有广阔的应用前景。

汉黄芩素；肝肿瘤；细胞凋亡

汉黄芩素全称是5，7-二羟基-8-甲氧基黄酮[1]，是传统中草药黄芩中发现41种黄酮类化合物的有效成分之一[2]。自从汉黄芩素被发现有抗肿瘤活性以来[3]，研究人员从卵巢癌[4]﹑乳腺癌[5]﹑鼻咽癌[6]等方面对汉黄芩素的抗癌作用及作用机制进行了深入的研究[7]，发现汉黄芩素对肿瘤细胞的杀伤作用有其独特的机制[8]。本研究将对此做进一步研究。

1 试剂及仪器

人肝癌SMMC-7721细胞株来源于本医院实验中心自我冻存；汉黄芩素购自上海源叶生物科技有限公司；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购﹑蛋白定量试剂盒﹑蛋白提取液等购自碧云天公司。

2 实验方法

2.1 MTT法检测不同浓度汉黄芩素作用细胞后对细胞增殖的影响

取处于生长对数期且生长状态良好的SMMC-7721细胞接种于96孔板中，接种密度5×104个/100 μL/孔。分别加入50﹑100﹑150﹑200﹑250 μmol/L的汉黄芩素作为实验组，并以不加汉黄芩素的作为对照组。分别作用24 h和48 h后在培养体系中加入MTT试剂染色，测定各孔A570。

2.2 Western-blot 检测细胞凋亡通路中关键蛋白Pro-caspase-9和Pro-caspase-8的表达水平

步骤如下：（1）利用汉黄芩素处理SMMC-7721细胞48 h；（2）超声细胞破碎机将细胞充分破碎；（3）将破碎后细胞混合物离心机10 000 g条件下离心15 min；（4）提取总蛋白；（5）SDS-PAGE蛋白质电泳进行蛋白分离；（6）电泳结束后将分离的蛋白转移PVDF印迹膜上；（7）5%脱脂奶粉中封闭2 h；（8）Pro-caspase-9和Pro-caspase-8的一抗与PVDF膜过夜孵育；（9）用PBST清洗混合液；（10）二抗抗体室温且避光条件下共孵育；（11）曝光显影；显影后图片用Bio-Rad Image分析系统查看。:

3 实验结果

3.1 MTT实验结果

不同浓度汉黄芩素作用肝癌SMMC-7721分别作用24 h和48 h后，实验结果显示，不同浓度的汉黄芩素均可以对SMMC-7721细胞的增殖产生抑制作用；作用时间越长，对细胞增殖的抑制作用越明显；作用48 h后，抑制细胞生长达50% 时的汉黄芩素浓度为210 μM。

3.2 Western Bolt检测Pro-caspase-9和Pro-caspase-8蛋白实验结果

利用汉黄芩素处理肝癌细胞48 h，提取细胞总蛋白并利用Western Bolt检测试剂盒检测细胞凋亡两种信号通路中的关键蛋白Pro-caspase-9及Pro-caspase-8的表达水平。Western Bolt检测结果显示：汉黄芩素作用肝癌细胞前后，作为参照的β-actin的灰度值分别为0.785﹑0.794；Pro-caspase-8的灰度值分别为0.598﹑0.612；Pro-caspse-9的灰度值分别为0.608﹑0.397。结果表明，Pro-caspase-8的表达水平并无明显变化（P=0.328＞0.05）；Pro-caspse-9的表达水平明显降低（P＜0.001）。

4 讨论

本研究在确认了汉黄芩素对肝癌SMMC-7721细胞的增殖抑制及肝癌细胞致死作用之后，对汉黄芩素促肝癌细胞凋亡的信号通路进行了探讨，以进一步揭示汉黄芩素对肝癌细胞的分子作用机制。

随着分子生物学研究的不断深入，极为复杂的细胞凋亡的信号通路和分子机制的研究取得了重大进展。细胞凋亡主要有两条信号通路：线粒体凋亡通路和死亡受体凋亡通路。线粒体通路又称内源性凋亡途径，在有药物诱导等外源性刺激情况下，分布于线粒体膜间隙的细胞色素C（Cytc）等促凋亡活性蛋白释放至包浆内，活化半胱氨酸天冬酶-9前体（Pro-caspase-9），从而激活半胱氨酸天冬酶-9（Caspase-9），进一步切割底物使细胞凋亡；死亡受体通路也成外源性凋亡途径，该途径为胞外信号所诱导的细胞凋亡途径，死亡因子受体（Fas）在胞外死亡去形成死亡诱导信号复合物（DISC）后引起胞质内Pro-caspase-8（半胱氨酸天冬酶-8前体）活化，从而激活Caspase-8（半胱氨酸天冬酶-8），进一步启动下游caspase相关蛋白酶级联反应，最终导致细胞凋亡。本研究结果表明汉黄芩素对人肝癌SMMC-7721细胞的增殖具有抑制作用，且汉黄芩素诱导细胞凋亡主要是通过线粒体信号通路实现。

综述所述，Pro-caspase-9和Pro-caspase-8的活化是两条细胞凋亡途径的主要区别。本研究通过Western Blot法检测了汉黄芩素作用前后人肝癌SMMC-7721细胞中Pro-caspase-9和Pro-caspase-8表达水平的变化，结果发现，汉黄芩素作用后Pro-caspase-9的表达水平明显降低而Pro-caspase-8的表达水平无明显变化。本研究表明，汉黄芩素对肝癌细胞的作用机制是通过线粒体信号通路实现的。汉黄芩素作为抗肿瘤药物尤其是在抗肝癌肿瘤方面具有广阔的应用前景。

[1]赵田禾，张莹莹，吴洋洋，等. 汉黄芩素及其衍生物的抗肿瘤作用及其分子机制的研究进展[J]. 中国新药杂志，2016，26（7）：760-766.

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The Anti-tumor Effect of of Wogonin for SMMC-7721 Hepatocellular Carcinom Cells and its Mechanisms

WANG Xiaodong Department of Pharmacy, The Sixth Affiliated Hospital of Zhongshan University, Guangzhou Guangdong 510000, China

ObjectiveTo observe the anti-tumor effects of Wogonin and investigate the underlined mechanisms preliminarily.MethodsSMMC-7721 cells were cultured with different concentrations of Wogonin and for 24 h or 48 h, cell viabilities were measured by the MTT assay, the expression levels of Pro-caspase-9 and Pro-caspase-8 were detected by Western-blot experiment.ResultsWogonin could inhibit the proliferation of SMMC-7721 cells, after cultured with the Wogonin, the expression levels of Pro-caspase-9 decreased obviously, and the expression levels of Pro-caspase-8 had no obvious decrease.ConclusionThe wogonin has the function of inhibition of the SMMC-7721 cells, the study shows that the wogonin induces tumor cells apoptosis by the mitochondrial pathway, there are broad application prospects for Wogonin as an anti-tumor drug.

Wogonin, Liver neoplasms, Apopatosis

R735.7

A

1674-9308（2016）34-0180-03

10.3969/j.issn.1674-9308.2016.34.100

中山大学附属第六医院药学部，广东 广州 510000