王燕平叶品良张传涛卢润生卢振方 陈 欢

·论著·

肺痨康治疗与KatG基因突变相关的耐异烟肼肺结核分子机制初探

王燕平1叶品良1张传涛2卢润生3卢振方 陈 欢1

目的探讨肺痨康治疗耐异烟肼肺结核的分子机制是否与KatG基因突变发生回复相关。方法 SPF级昆明种小鼠80只随机分为标准菌株组、对照组、异烟肼组、肺痨康组，各20只；分别给予生理盐水、生理盐水、异烟肼液、肺痨康液连续灌胃56天。处死小鼠解剖分离出肺组织，每组随机抽取1～2只感染小鼠肺组织提取结核分枝杆菌DNA进行全基因组检测。分析各组小鼠肺组织耐药分枝结核杆菌基因突变情况。结果 （1）标准菌株组基因序列与参考值一致；对照组与参考值比较仅KatG基因突变。（2）与对照组比较，异烟肼组、肺痨康组KatG基因突变位点未见基因回复现象，但发现更多突变位点。（3）与异烟肼组比较，肺痨康组不仅存在相当大部分新生突变位点重合现象，还出现仅肺痨康组存在的新生突变位点，其密码子对氨基酸表达影响程度达“HIGH”。结论 异烟肼、肺痨康对KatG基因突变导致的耐异烟肼肺结核均有治疗作用。肺痨康组治疗作用可能与新突变位点（RV0063）改变有关。

耐药肺结核；肺痨康；KatG基因突变；分子机制

肺痨康是临床治疗肺结核的经验方，由蒸百部、蛤蚧、天冬等十二味中药组成。前期研究[1]发现，肺痨康治疗肺结核可以促进结核病患者临床症状和肺部体征消失，促进肺部病变吸收，痰涂片转阴，对结核分枝杆菌，尤其是对耐异烟肼等耐药结核分枝杆菌有抗菌作用[2-3]。目前研究[4-5]提示，耐异烟肼肺结核分支杆菌的耐药机制主要与结核分枝杆菌katG和inhA基因突变与耐异烟肼相关。本课题组提出肺痨康可能通过影响耐异烟肼肺结核的基因突变位点发生变化从而对其产生治疗作用。本研究采用小鼠尾静脉注射法建立单耐异烟肼肺结核小鼠模型[6]，提取经高剂量肺痨康治疗后的耐异烟肼肺结核小鼠肺组织中的单耐异烟肼结核杆菌DNA，通过全基因测序技术检测对比分析统计，初步探讨肺痨康治疗耐异烟肼肺结核的分子机制。

1 材料与方法

1.1 动 物 SPF级昆明种小鼠80只，雌雄各半，体质量18～22g，由成都达硕生物科技有限公司提供。动物实验合格证号：SCXK（川）2013-24。

1.2 实验菌株 结核分枝杆菌单耐异烟肼菌株、结核杆菌标准菌株H37·Rv均由四川省疾病预防控制中心结核病防治研究所提供。

1.3 治疗用药 肺痨康水煎液制备：蒸百部15g，蛤蚧10g，天冬15g，川贝母6g，紫河车10g，北沙参15，阿胶10g，天花粉15g，三七粉6g，猫爪草24g，海浮石20g，白及15g等。采用传统方法煎煮。用电子恒温水箱60℃低温将煎煮好的药液浓缩至含生药1g/mL，4℃冰箱保存，加热使用。所需药物均购自北京同仁堂成都分店。异烟肼液制备：异烟肼片（沈阳红旗制药有限公司，批号：1309021）100mg磨成粉状，加入蒸馏水4mL稀释，混合均匀。

1.4 主要仪器及试剂 电子称重天平（广州中山市金利电子衡器有限公司）；4℃冰箱（海尔集团）；电子恒温水箱（北京中兴伟业仪器有限公司）；聚合酶链反应(PCR)扩增试剂盒（上海基因科技有限公司提供）。Qubit 2.0荧光定量仪（Invitrogen，Q32866）；Magnetic Stand-96试剂（Life Technologies，AM-10027）；Agilent 2100 Bioanalyzer芯片分析系统（Agilent，G2939AA）；HiSeq 2500 Sequencing System测序系统（Illumina，SY-401-2501）；TruSeq DNA LT Sample Preparation Kit建库（Illumina，FC-121-2001）；A-gencourt AMPure XP Beads（Beckman，A63881）。

2 实验方法

2.1 肺结核小鼠模型制备及分组 小鼠于实验室环境适应性饲养1周，随机分为标准菌株组（H37· Rv）、对照组（突变耐药菌株组）、异烟肼组、肺痨康组，每组20只。标准菌株组小鼠尾静脉注射H37·Rv结核标准菌株,其余三组分别注射与KatG基因突变相关的耐异烟肼菌悬液0.1mL（含105cfu细菌，建立肺结核动物模型[7]。

2.2 治疗给药 各组动物于造模1周后开始灌胃治疗。（1）肺痨康组：参照前期实验研究结果[2]并按国家中药管理局的相关规定，以6g/kg为高剂量进行灌胃治疗；（2）异烟肼组：给予同体积的异烟肼灌胃。参照相关指南[8]，对耐药结核病给予高剂量异烟肼[0.016～0.02g/（kg·d）治疗，以正常成人体质量70kg，小鼠体质量20g按体表面积比（0.0026）等效剂量进行换算，小鼠给药量为 0.15g/（kg·d）；（3）标准菌株组（H37Rv）及对照组：分别给予同体积的生理盐水灌胃。以上四组均每日灌胃1次，连续灌胃56天。

2.3 小鼠肺组织耐药结核分支杆菌全基因组测序颈椎脱臼法处死小鼠后，用75%酒精消毒小鼠体表5min，无菌条件下解剖小鼠，分离出肺脏，在接种菌株的各实验组随机取1～2只小鼠肺组织标本，分离出结核分支杆菌。采用DNeasy Blood&Tissue Kit （Qiagen，69506）按照生产厂商提供的操作流程进行结核分枝杆菌DNA抽提及纯化，纯化后的DNA经Qubit 2.0 Fluorometer和0.8%琼脂糖凝胶电泳进行质检，质检合格的DNA进行后续的测序实验。按照实验说明书对基因组DNA进行片段化，末端修复、3’末端加A、连接接头、富集等步骤，完成测序样本文库构建。所建文库使用Qubit 2.0 Fluorometer检测浓度，按照 cBot User Guide所示相应流程，在Illummina HiSeq 2500测序仪配套的 cBot上完成Cluster生成和第一向测序引物杂交。按照HiSeq 2500 User Guide准备测序试剂，将携有cluster的flow cell上机测序。测序过程由Illumina提供的data collection software进行控制，并进行实时数据分析。

2.4 统计学方法 使用bwa软件（version 0.7.8）对预处理后的上机读取结果 reads进行序列对比（Mapping）（参考基因组为肺结核杆菌H37RV标准菌（REF），参考基因组下载链为：http://ftp.ncbi.nih. gov//genomes/Bacteria/Mycobacterium-tuberculosis-H 37Rv-uid57777）组间样本基因序列同一位点筛选对比。

3 结果

3.1 肺痨康、异烟肼组不同“HIGH”突变位点与野生型对照组比较 从各组样本随机选取1～2个样本进行全基因组测序，标准菌株组抽取D16号，对照组抽取17号，异烟肼组抽取19号，肺痨康组抽取D21、25号，结果如下：（1）在基因序列第68156位置，标准菌株组及异烟肼组系统未获取到核苷酸信息；对照组显示“0/0”不存在由参考序列“G”向“T”突变或多态性，肺痨康组D21号样本显示“0/1”位点核苷酸序列存在多态性；肺痨康组25号样本结果同对照组。在基因序列第392261位置，标准菌株组、对照组及异烟肼组分别显示“0/0”无突变或多态性，“0/1”多态性，“1/1”突变结果；肺痨康组D21号、25号样本系统均未获得信息。染色体NC-000962.3第68156位置标准菌株组、对照组、异烟肼组未检测到基因突变现象，而肺痨康组样本提示存在多态性可能，即核苷酸“G”向“T”转变的不稳定性。第392261位置，与标准菌株比较，对照组存在“错义突变”将原编码终止密码子的密码子转为编码谷氨酰胺的密码子的多态性改变，异烟肼组发生“错义突变”，而肺痨康组在该位置系统未获得检测结果。见表1。

表1 肺痨康、异烟肼组不同“HIGH”突变位点与野生型对照组比较

3.2 肺痨康、异烟肼均发生“HIGH”突变的各位点与标准菌组及对照组比较 与标准菌株组比较，在染色体 NC-000962.3第 123454、2337179、4351039、4383655位置的核苷酸，对照组存在多态性，异烟肼组与肺痨康组存在完全突变；在3717105位置标准菌株组、对照组与参考序列对比核苷酸均为多态性状态，异烟肼组、肺痨康组与参考序列对比则结果一致。见表2。

表2 肺痨康、异烟肼均发生“HIGH”突变的各位点与标准菌组及对照组比较

3.3 四组样本KatG基因突变位点比较 标准菌株组经PCR测序证实在KatG基因位置未发生突变，对照组与标准菌株组比较存在多态性，异烟肼组与肺痨康组存在突变；经异烟肼和肺痨康治疗干预后该突变位点，并未发生突变基因回复，相反，该位置基因存在形式由动态性转变为突变。见表3。

表3 四组样本KatG基因突变位点比较

3.4 染色体以下位置碱基突变情况及所导致氨基酸序列改变总览 第68156、123454、1037911、2337179、3717105、4351039位置基因编码序列分别由Gaa→Taa、Caa→Taa、Cga→Tga、Gaa→Taa、Cag→Tag、Gaa→Taa转变，其分别导致原编码412位谷氨酸、380位谷氨酰胺、305位精氨酸、609位谷氨酰胺、6位谷氨酰胺、99位谷氨酸的密码子变为终止密码，使氨基酸链的合成终止，即发生“无义突变”，从而影响所表达蛋白的性质。第392261、4383655位置发生“错义突变”，导致原来的终止密码子变为分别编码75位谷氨酰胺、111位谷氨酰胺的密码子。见表4。

表4 各组染色体以下位置碱基突变情况及所导致氨基酸序列改变总览表

4 讨 论

目前多数研究[9-11]表明，结核分支杆菌耐异烟肼的产生与过氧化氢酶—过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关，KatG基因导致的MTB触酶—过氧化物酶活性降低或缺失可以解释90%以上的异烟肼耐药。本次研究在前期临床中药复方肺痨康治疗耐异烟肼结核病患者临床有效以及动物实验和体外药理等实验[1-3]基础上，继续深入对耐药结核分枝杆菌基因层次进行探讨。实验结果显示，经肺痨康、异烟肼干预治疗后，在KatG基因突变位置并未发现基因回复现象，否定了本实验最初的探索性假设，但是本次实验有一定新发现，全基因测序发现结核分枝杆菌的NC-000962.3染色体第68156位置经肺痨康干预治疗后与其它三组比较，肺痨康组存在“基因多态性”现象，该基因RV0063所编码蛋白功能虽暂不完全明确，但其可能编码相关过氧化酶，类似于rv3107c，rv1257c等编码结核分枝杆菌蛋白，如与过氧化还原酶ps00862含有共价FAD结合位点[12]，当该处核苷酸由“G”变为“T”后，则该处基核苷酸序列发生“无义突变”，使氨基酸的编码终止，导致编码412谷氨酸的密码子变为终止密码，使氨基酸链继续形成终止，使蛋白的继续表达中断，而异烟肼治疗组没有这一变化，肺痨康治疗耐异烟肼结核病的作用是否与这种改变有直接相关性尚不能肯定。另外在所有表格所列的其它基因位点上，异烟肼组、肺痨康组均发生相同改变，也说明肺痨康在治疗耐药结核分枝杆菌上可能有类似于异烟肼的作用，但这些位点所编码的蛋白，其功能目前还未被研究证实。

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（收稿：2015-10-20 修回：2015-12-07）

Molecular Mechanism of Isoniazid Resistant Tuberculosis Associated with KatG Gene Mutation by Treat-ment with Feilaokang

WANG Yanping1,YE Pinliang1,ZHANG Chuantao2,LU Runsheng3,LU Zhenfang1,CHENHuan1. 1 Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu(610075);2 Department of Infectious Disease,Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional ChineseMedicine,Chengdu(610072);3 Sichuan Provincial Center for Disease Control and Prevention,Chengdu(610041),China

ObjectiveTo explore the molecular mechanism of Feilaokang treating isoniazid-resistant tuberculosis is related to KatG gene mutations with or without reply.Methods Eighty SPF mice were randomly divided into standard strain group,control group,isoniazid group,and Feilaokang group,in each group of 20 mice.Mice in the above groups were given saline,saline,isoniazid,and Feilaokang by gavage for 56d,respectively,then the mice were sacrificed and the lung tissues were dissected and isolated,and 1-2 of the DNA infected mice in each group were randomly selected to extract mycobacterium tuberculosis.Results The gene sequence of mycobacterium tuberculosis in standard strain group was consistent with reference;that of control group had KatG gene mutation.Compared with control group,isoniazid and Feilaokang groups had more KatG gene mutations with out reply.Compared with isoniazid group,Feilaokang group had more de novo KatG gene mutations,and some of the mutations were only observed in Feilaokang group.The codon of the mutation had high accuracy in specifying the amino acid. Conclusion Both of Isoniazid and Feilaokang can treat isoniazid-resistant tuberculosis induced by KatG gene mutations.The effect of Feilaokang may be related to the new mutation site RV0063.

drug-resistant tuberculosis;Feilaokang;KatGgene mutation;molecular mechanism

国家自然科学基金资助项目（No.81173382）

1成都中医药大学（成都 610075）；2成都中医药大学附属医院感染科（成都 610072）；3四川省疾病预防控制中心（成都 610041）

叶品良，Tel：13881839284；E-mail：mrypl@163.com