曹顶臣，佟广香，吕伟华，孙志鹏，匡友谊，郑先虎，孙效文

（中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070）

利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼ifi30基因

曹顶臣，佟广香，吕伟华，孙志鹏，匡友谊，郑先虎，孙效文

（中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070）

利用CRISPR/Cas9技术，在斑马鱼Danio rerio干扰素γ诱导蛋白30（ifi30）基因的第一个外显子处选取靶位点，用PCR法构建gRNA，并进行体外转录。将体外转录的sgRNA和Cas9mRNA显微注射到斑马鱼1细胞期的受精卵中，实现对靶基因ifi30的沉默。注射后24h检测发现，基因突变率在79%～95%之间，平均突变率为87.2%。为了获得稳定遗传的基因突变纯合系，将F0代与野生型斑马鱼进行配组，获得了3种突变类型的F1代，其突变率为30%。三种突变类型中突变1和突变2为移码突变，突变3删除了6个碱基，并未造成移码。突变1和突变2的F1代杂合个体生长发育未见异常。将杂合F1代自交，理论上将获得突变纯合个体，但仅在受精2h以内的胚胎中检测到了突变纯合个体，受精24h后的胚胎中，只有野生型和杂合型，未见突变纯合个体。推测ifi30基因的移码突变造成了干扰素γ诱导蛋白的缺失，导致胚胎死亡。

斑马鱼；ifi30；CRISPR/Cas9技术；敲除

斑马鱼Danio rerio个体小、发育快、易于饲养、性成熟周期短、繁殖力强、体外受精、胚胎在母体外发育，且受精卵透明、易于操作，已成为常用的动物模型[1]，越来越多地被用于免疫相关研究中。干扰素γ诱导蛋白30（ifi30）作为一种可溶性的蛋白质，能够在催化二硫键的还原，参与抗原呈递和加工以及对机体病毒免疫、肿瘤免疫、寄生虫抗原免疫应答产生影响，ifi30的缺失可能会对机体病毒免疫[2,3]、肿瘤免疫[4,5]、寄生虫的抗原免疫应答造成影响，还可能引起自身免疫病的发生和发展[6]。……