林菁艳，陈静，黄三，林静，马丁，彭彬

(1.川北医学院附属医院麻醉科，川北医学院麻醉学系；2.南充市中心医院；3.川北医学院细胞化学研究室，四川 南充 637000)



糖尿病性神经痛大鼠脊髓背角突触数量的体视学研究

林菁艳1，陈静2，黄三1，林静1，马丁1，彭彬3

(1.川北医学院附属医院麻醉科，川北医学院麻醉学系；2.南充市中心医院；3.川北医学院细胞化学研究室，四川 南充 637000)

目的：探讨糖尿病性神经痛(painful diabetic neuropathy,PDN)大鼠脊髓背角突触数量的变化。方法：10只健康成年雄性SD大鼠，随机分为两组(n=5)：PDN组和对照组(C组)。PDN组采用腹腔注射6%STZ 60 mg/kg建立糖尿病大鼠模型，C组腹腔注射等容生理盐水。注射后72 h测定空腹血糖(FBG)，以FBG>11.1 mmol/L为糖尿病建模成功。注射STZ前1 d及血糖升高后第4、7、14、28 天分别测定大鼠的机械痛阈。第28天测痛后取L5段脊髓，进行突触素免疫组织化学染色，采用光学体视框交替计数一侧脊髓背角内突触的数量。结果：PDN组大鼠FBG均达糖尿病诊断标准，自FBG升高后 4 d开始痛阈降低，至28 d时未恢复。与C组比较，PDN组L5节段脊髓背角内突触数量增加(P<0.05)。结论：PDN大鼠脊髓背角突触数量增加，突触数量增加可诱导PDN的发生。

糖尿病性神经痛；中枢敏化；突触可塑性；骨髓背角

糖尿病性神经痛(painful diabetic neuropathy,PDN)是神经病理性疼痛的一种类型，是糖尿病常见的并发症之一。其主要表现为感觉麻木，自发性疼痛，痛觉过敏和异常疼痛[1]等。文献报道，其发病率为20%～47%[2-3]，长期慢性疼痛严重影响患者的生活。由于目前对其发病机制了解不多，故而临床治疗满意度并不高。过去曾认为其发生机制主要为周围神经病变，外周神经敏化。目前，越来越多的研究显示，PDN的发生不仅存在周围神经系统病变，中枢神经系统的可塑性改变(中枢敏化)也是其可能机制[4-5]：PDN大鼠脊髓背角内谷氨酸能神经元兴奋性突触后电位增强[6]，N-甲基-D天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体和γ-氨基丁酸B(GABAB)受体失衡[6]，脊髓背角内伤害感受性神经元回路改变[7]及感觉神经传入纤维增多[8]。据此我们推测：上述脊髓背角内的可塑性变化，可能造成PDN大鼠脊髓背角内感觉神经元之间建立新的突触联系，导致突触数量增加，从而导致脊髓背角内感觉神经元兴奋性增强，感受野扩大，其相应的外周感受野对同样刺激的感受增强，阈值降低，进而引起自发性疼痛、痛觉过敏和异常疼痛，导致PDN的发生发展和维持。目前尚未见PDN大鼠脊髓背角内突触数量的相关报道。因此，本研究拟采用体视学方法——光学体视框来观测PDN大鼠脊髓背角内突触和神经元数量的变化，为PDN发生的中枢敏化机制增添新的解剖学资料。

1 方法

1.1 动物选择及分组

健康成年SD雄性大鼠10只，体重220～250 g，由川北医学院实验动物中心[许可证号：SCXK(川)2008-18]提供。随机分为两组(n=5)：PDN组和生理盐水对照组 (C组)。所有动物单笼喂养，自由进食饮水，昼夜交替。适应3 d后进行实验。对动物的所有处理均符合本院伦理委员会关于实验动物伦理学要求。

1.2 糖尿病大鼠模型的制备

所有动物适应性喂养3 d后禁食12 h，分别经腹腔注射6% STZ (sigma公司，美国)60 mg/kg和等容积的生理盐水。72 h后取尾静脉血，以强生倍优型血糖仪及配套试纸测定大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)，以FBG>11.1 mmol/L为糖尿病造模成功标志[9-11]。

1.3 机械痛阈测定

分别于注射STZ前1 d、FBG升高后第1、7、14、28 天时采用动态平板Von Frey测痛仪(Ugo Basil，37450，意大利)采用改良“up and down”法测定大鼠双侧后足的50%缩腿阈值[12-14](PWT)：将大鼠放在一铁丝网架上，用透明塑料观察框罩住。待大鼠适应环境15 min，并处于清醒、安静状态(无走动，无洗脸、瘙痒等动作)，以测痛仪依次交替刺激大鼠一侧后肢第4、5趾底，从低到高选择刺激力度，刺激力度从10 g开始，若无反应，则以2 g的间距逐渐增加刺激力度。为避免对大鼠造成损伤，最大刺激力度为30 g，每个力度刺激6～8 s，重复4次，相邻刺激位置间隔一定距离，以避免出现耐受现象。4次刺激一旦有1次出现阳性反应，则继续该刺激2次，6次刺激中有3次阳性反应的刺激力度则为该侧后足的50%缩腿阈值。

1.4 切片制备

FBG升高后第28天时，测试痛阈后经腹腔注射3%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉，开胸，经左心室插管至升主动脉，剪开右心耳，以生理盐水灌注冲洗血液。待右心耳流出液体变清亮后，以4%多聚甲醛经心脏灌流内固定。待大鼠颈部及肝脏僵硬时，灌注结束。分离脊髓，取L5节段石蜡包埋。沿垂直于脊髓长轴的方向，从中连续切取30张14 μm厚的切片，按照等距随机原则，每隔6张抽取一张切片，抽取的第一张切片在前6张切片中随机选取，共抽取5张切片。按这种方法抽选出2套切片，分别进行甲苯胺蓝尼氏染色(显示神经元为主)和突触素的免疫组织化学染色(显示突触前终末为主，其数量即突触数量)[14-15]。

1.5 突触素免疫组织化学染色

切片经常规脱蜡至水，经0.01 mol/L枸橼酸缓冲液抗原修复、3%H2O2去离子水消除内源性过氧化物酶活性和山羊血清封闭非特异性抗原后，滴加小鼠抗大鼠突囊泡蛋白单克隆抗体(稀释度1∶500，Millipore公司，美国) 4 ℃孵育24 h。依次加入生物素二抗、辣根酶标记链霉卵白素工作液(北京中杉金桥生物技术有限公司)，每一操作步骤期间用0.01 mol/L的PBS液冲洗3 min×3次。DAB显色，苏木素复染，盐酸酒精分色，常规脱水，透明，封片。另取相邻切片，采用正常山羊血清代替一抗作为阴性对照。

1.6 尼氏染色

切片常规脱蜡至水后，置入57 ℃的0.01%甲苯胺蓝溶液中染色5 min，自来水终止，经95%乙醇分色后，常规脱水，透明，封片。

1.7 体视学估计

对各组内切片脊髓背角的左右侧交替进行观测，以消除动物自身因素可能造成的误差。采用现代体视学设备NewCAST系统(Visiopharm公司，丹麦)及BX51型光学显微镜(Olympus公司，日本)，在电脑上进行观测。先在低倍物镜下勾勒出所选定侧脊髓背角区域[12-13]并测定其面积(A)。UPlanSApo油镜(×100, 数值孔径1.40)下进行计数。组织图像的最终放大倍数为2 240。

1.7.1 突触的计数 参照文献[14-16]介绍的方法进行计数：首先在勾选区域的最左上角随机确定第一个测试视野，然后按照0.2 μm的间距利用电动载物台在勾选区域内由系统自动等距抽选视野。油镜下，每个视野叠加2个面积为57.02 μm2的长方形测试框。

从切片上表面向下0.5 μm的光学切片平面开始，手动调节向下连续聚焦观察3 μm厚的切片组织，根据光学体视框计数法则[9-11,14]计数体视框(每个体视框的体积为57.02 μm2×3 μm=171.06 μm3)内的突触素颗粒的数量。

所计数的突触素颗粒的总数除以用于计数的体视框总体积即得单位体积脊髓背角内的突触的数量(Nv，即数密度)。将所得突触数量乘以1 mm长脊髓节段内脊髓背角的体积(A×1 mm)，即得每1 mm长脊髓内所测突触的数量(不考虑切片压缩)。

1.7.2 神经元计数 系统自动的等距随机抽选一定的脊髓背角区域，在每个视野上随机叠加一个面积为2 074.22 μm2的长方形光学体视框。脊髓背角区域内的测试总面积设定为脊髓背角横切面积的5%。从切片上表面向下0.5 μm的光学切片平面开始，向下连续聚焦观察7 μm厚的切片组织，根据光学体视框计数法则计数体视框(体视框的体积为2 074.22 μm2×7 μm=14 519.54 μm3)内的神经元核仁数。所计数的核仁总数除以用于计数的体视框总体积即得单位体积脊髓背角内的核仁数量。脊髓背角内每个神经元的细胞核内通常都有且只有1个核仁，很少有2～3个核仁，因此我们估计的核仁数等于神经元数。将所得神经元数量乘以1 mm长脊髓节段内脊髓背角的体积，即得每1 mm长脊髓内所测神经元的数量(不考虑切片压缩)。

1.7.3 突触/神经元比值 以单位长度脊髓背角内的突触数量除以神经元数量，即得突触/神经元比值。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠血糖及机械痛阈

PDN组大鼠在注射STZ72h后FBG均>11.1mmol/L，且不随时间推移而下降，同时还伴随皮毛光泽度下降、色黄，精神萎靡等症状。

与造模前及C组相比，PDN组大鼠在FBG升高后4d开始出现痛阈降低，至术后28d时未恢复(P<0.05，表1)。

表1 空腹血糖升高前后各时间点大鼠50%缩爪阈值的变化(n=5)

组别升高前1d升高后4d升高后7d升高后14d升高后28dPDN组18.8±0.613.8±0.4*#10.6±0.7*#11.8±1.4*#11.0±0.6*#C组19.2±0.817.6±1.717.6±0.718.0±0.517.8±0.5

*P<0.05,与血糖升高前相比;#P<0.05,与C组相比。

2.2 L5节段脊髓背角内体视学测量

与C组相比，PDN组大鼠在FBG升高后28 d时单位长度脊髓背角内突触数量及突触/神经元比值明显升高(P<0.05)，而神经元数量及两组大鼠脊髓背角面积无显著性差异(P>0.05)(表2，图1)。

表2 血糖升高后第28 d时各组大鼠的L5段脊髓背角内体视学结果(n=5)

PDN组C组脊髓背角面积(mm2)0.56±0.060.51±0.08突触数量(106/mm长脊髓)16.05±2.72*11.82±2.69神经元数量(103/mm长脊髓)71.98±12.4968.07±9.54突触/神经元比值224.08±22.30*172.20±18.20

*P<0.05，与C组相比。

3 讨论

STZ通过直接破坏大鼠胰岛β细胞而诱发糖尿病，广泛用于糖尿病动物模型的制备[20-21]。本研究根据文献及预实验结果选取STZ 60 mg/kg用于建立糖尿病大鼠模型。PDN组大鼠在注射STZ后72h的FBG均达到糖尿病诊断标准。在FBG升高后第4d出现机械痛阈明显降低，至28 d时未恢复。说明PDN建模成功并持续发展。

体视学(stereology)是始于20世纪60年代的一门学科，是利用所测结构的图像的几何特征来定量研究所测结构本身的几何特征(包括体积、表面积、长度、数目等)的方法学[19]。体视学方法中的系统抽样和体视框的运用，提供了较高水平的解剖分辨力，在粒子定量研究方面较传统的基于对灰度值、光密度的比较等方法有着更为客观和准确的优势[22]。

采用体视学的新工具——光学体视框，我们前期实验[14-15]已经证明，坐骨神经损伤后的神经病理性痛大鼠其脊髓背角的可塑性改变主要发生在L5节段，因此本研究中主要观测了L5节段突触和神经元数量的变化。

研究表明：PDN的发生机制不仅仅是周围神经病变，中枢敏化也在其发生发展中起着重要作用。脊髓背角是疼痛信息传递和整合的初级中枢。PDN的外周神经病变导致伤害性传入冲动增加，可导致初级感觉神经元过度兴奋，进而引发脊髓背角伤害感受性神经元兴奋性增高，突触联系发生功能性或质的变化，进而发生中枢敏化，导致痛觉过敏或自发痛。PDN大鼠脊髓背角内神经回路发生重组，感觉神经纤维传入增多[8]，因此可能建立新的突触联系，导致PDN大鼠脊髓背角内突触数量增多。本研究采用现代体视学方法，证明了PDN大鼠L5节段单位体积脊髓背角内突触数量明显增多而神经元数量无显著性改变。同时，考虑到脊髓在组织学处理过程中可能产生的变化，我们还计算了突触/神经元比值。这一比值不受参照空间(脊髓背角)体积改变的影响，其结果与突触数量的变化具有一致性，说明单个神经元所拥有的突触数量增加。

突触数量的增加可能导致神经元的一系列功能变化：谷氨酸能神经元兴奋性突触后电位增强[6]，突触内神经递质和神经调质的合成与释放增加，感觉神经元冲动的发放和传导频率增加、速度增快，从而导致糖尿病性神经痛患者自发性疼痛、痛觉过敏和异常疼痛的发生。而增加的突触中兴奋性或抑制性突触的比例，以及其他脊髓阶段内甚至更高一级中枢——大脑中相关区域是否有相应的突触可塑性改变尚有待进一步研究。

综上所述，PDN大鼠脊髓背角内突触数量增多，可能导致感觉神经元兴奋性增加，其相应的外周感受野对同样刺激的感受增强，阈值降低，感受野扩大，进而引起自发性疼痛、痛觉过敏和异常疼痛，导致PDN的发生发展和维持。本研究为阐明PDN发生的中枢机制增添了新的解剖学证据，提示脊髓背角突触数量的增加可能是导致糖尿病性神经痛患者中枢敏化和自发痛、痛觉过敏及异常疼痛的解剖学基础。也为糖尿病性神经痛的治疗提供了新的思路：抑制脊髓背角内感觉传入纤维的增加和突触数量的增多。

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(学术编辑：文晓红)

Stereological study on the synaptic number in the rat spinal dorsal horn with painful diabetic neuropathy

LIN Jing-Yan1,CHEN Jing2,HUANG San1,LIN Jing1,MA Ding1,PENG Bin3

(1．DepartmentofAnesthesiology,NorthSichuanMedicalCollege,AffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege；2.NanchongCentralHospital；3.CytochemicalResearchLaboratory,NorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,Sichuan,China)

Objective：To investigate the plasticity change of the synaptic number in the rat spinal dorsal horn with painful diabetic neuropathy.Methods：10 healthy adult male SD rats were randomly divided into 2 groups (n=5): the PDN group and the control group.Rats in the two groups were intraperitoneally injected with 6%STZ 60mg/kg or normal saline respectively.72 hours after injection,fasting blood glucose (FBG) were measured,FBG>11.1 mmol/L were considered a successful diabetes mellitus model.1day before injection and4,7,14,28 days after increasing of FBG,the mechanical pain threshold were measured.28 days after increasing of FBG,the L5 segment of spinal cord were separated and stained with synaptophysin immunohistochemisty.The numerical density of synapses in the spinal dorsal horn was estimated respectively.Results：In the PDN group,FBG rose after injection of STZ,and the pain threshold decreased 4 days after increasing of FBG.Compared to control group,numerical density of synapses increased significantly in the spinal dorsal horn in the PDN group (P<0.05).Conclusion：The rat model of PDN is associated with increase of the synaptic numbers in the spinal dorsal horn of L5 segment.

Painful diabetic neuropathy;Central sensitization;Synaptic plasticity;Spinal dorsal horn

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.06.008

四川省科技厅项目(2013JY0161)；四川省教育厅重点项目(16ZA0238，15ZA0214)

2016-08-28

林菁艳(1979-)，女，博士，副教授。

彭彬，E-mail: 340255492@qq.com

时间：2017-1-3 22∶01

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170103.2201.016.html

1005-3697(2016)06-0809-04

R741

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