王 潇 陈 健

(厦门大学医学院，福建 厦门 361000)



·综 述·

高通量测序技术在骨质疏松研究中的应用

王 潇 陈 健

(厦门大学医学院，福建 厦门 361000)

高通量测序技术；精准医疗；骨质疏松

高通量测序(HTS)技术几乎改变了生物医学科学的每一个领域，近年来高通量测序技术发展飞快，将人们真正带入了HTS的时代。新一代高通量测序技术具有测序通量高、测序时间短和测序成本低等特点。2015年初，美国总统奥巴马宣布推出精准医疗计划〔1〕。精准医疗是在分子生物学基础上更精准、更个体化的医疗。HTS技术为精准医疗的实施提供了强大的技术支撑，为疾病的研究、预防、诊断及治疗提供了更精准，更有效的手段。随着老龄化社会的到来，骨质疏松(OP)已成为影响人们生活质量的一大疾病。60岁以上老年人，OP发病率男性为35.8%，女性为73%，接近40%的妇女一生中都会发生OP导致的骨折〔2〕。而OP的发生、发展是一个多基因控制的复杂过程。因此，HTS技术的发展能更加系统地阐述OP的发生、发展机制及为其诊断和治疗提供强有力的工具。

1 HTS技术简介

HTS技术也称深度测序技术或下一代测序技术〔3，4〕。其在基因组测序、转录组测序、基因变达调控、转录因子结合位点的检测以及甲基化等研究领域都有应用。最早被用于DNA测序的是产生于19世纪70年代中期的传统的Sanger测序技术〔5〕，其测序耗时长，通量低，费用高，因此下一代测序技术应势而生。目前所说的HTS技术主要是指2005年以来454 life sciences公司(现已被Roche公司收购)、ABI公司和Illumina 公司推出的第二代测序技术以及Helicos Heliscope和Pacific Biosciences推出的单分子测序技术〔6〕。此外，还有第三代的纳米孔测序技术。这些技术的出现真正达到了一个基因组测序不超过2 000美元〔7〕。第二代测序技术有Roche/454公司的焦磷酸基因组测序技术，Polonator技术，Illumina 公司的Solexa技术，ABI公司的Solid技术等。这里介绍近年来应用较普遍的测序平台。Illumina/Solexa公司2006年推出了AnalyzerⅡ〔7〕，随后的几年里不断改进，提高了测序通量，降低了测序成本，占据了HTS的市场。该公司最近推出了一套测序时间和测序通量最优化的测序仪，包括Miseq、NexSeq500、Hiseq系列。其中Miseq和Hiseq是最成熟的测序平台〔7〕。Miseq测序速度快，适合个人基因组测序、目标测序和小基因组测序。Hiseq2500测序通量高。其在2014年推出的HiseqX10〔7〕，运用图案化流动槽技术，具有高通量、耗时短等特点。之后推出的NexSeq500〔7〕，采用一种新型双通道测序方法，而Miseq和Hiseq都是四通道的测序方法。它的特点是核苷酸的检测只需两张图片，减少了数据处理时间和提高了测序通量。但其误差率与成熟的Hliseq平台相似。2010年Life Technologies 公司推出PGM测序仪，其模版准备和测序步骤与Roche/454的焦磷酸测序技术类似〔7〕。在PGM基础上，2012年又推出了Ion Proton测序仪，提高了测序通量。除此之外，Pacific Biosciences 公司推出的单分子实时测序技术(SMRT)，其特点是不需扩增过程，聚合过程是连续的，可以通过视频上记录的荧光信号实时读取DNA序列。Dxford Nanopore technoloqies 公司在2014年推出了纳米孔测序技术〔8〕，最早的设备是MinION，测序速度较快，读长较长。如同所有的单分子测序技术，错误率很高，Jain等〔9〕最近报道其插入、删除、替换率分别为4.9%，7.8%，5.1%。虽然其测序通量相对较低，精确度不高。但其在尺寸、测序速度、读长、机器价格等方面的优势，将使其在不久的未来有着更好的发展。HTS技术一直在不断地完善，不断的改进，并被广泛应用于生物科学的各个方面。

2 HTS技术在OP研究中的应用现状及存在问题

2.1 HTS技术在OP研究中的应用现状 OP是最常见的代谢性骨病，作为最常见且治疗费用最高的疾病之一，影响着全世界1/3的女性和1/5的男性〔10〕。其特点是具有低创伤性骨折的风险，将近1/2女性和1/4男性在60岁以上都会受OP性骨折的影响〔11〕。其中最严重的是髋部骨折，50%人骨折后不能恢复到骨折前的状态，25%需长期家庭护理，还有25%在12个月之内死亡〔12〕。OP是一种多基因控制的家族性疾病。体内成骨细胞与破骨细胞在骨重塑过程中扮演着重要角色。成骨细胞来自造血干细胞，破骨细胞来自骨髓间充质干细胞，而骨细胞是从成骨细胞分化而来的。骨吸收与形成的不平衡导致了OP的形成。目前已知的WNT、NOTCH、Hedgehog、OPG-RANK-RANKL等信号通路可以调节成骨细胞和破骨细胞分化和形成。HTS技术可以检测低频率的与疾病相关的罕见的变异基因，而且已经成功地应用于描绘单基因疾病〔12〕。全基因组相关研究(GWAS)和全外显子组测序(WES)可以帮助确定基因决定的单基因疾病和复杂疾病，包括OP和骨量紊乱等疾病。该方法已被用于发现导致OP的新基因〔10〕，可以提升对OP发病机制的理解和推动寻找新型靶向治疗的发展。影响OP性骨折的因素很多，除了钙缺乏、雌激素缺乏、年龄因素、以前是否有过骨折等，还有骨密度(BMD)。BMD具有高度遗传性的特点，60%～90%的人骨密度变化是由基因决定的〔13〕。当然，除了BMD之外，其他与OP相关的特征也与遗传因素相关。受研究技术的限制，传统的疾病在基因方面的研究主要是以假说为导向的候选基因法。本世纪初，在描绘OP和大部分其他复杂疾病的基因上进展很小。但随着全基因组相关研究的发展和下一代测序技术的出现，更多新的与BMD减少相关的基因位点被发现。近年来相关综述表明发现有59个新的基因位点与BMD减少相关，而这些位点在以前的候选基因法中未被发现〔14〕。随着科学技术的不断发展，高通量基因分型技术的出现，将对OP及一些其他复杂疾病进行更进一步的分型，有利于提高对疾病的认识，对疾病的风险进行更好预测，寻找更精准的治疗方法和减少治疗过程中副作用的产生。HTS技术除了在基因组测序上的应用之外还在转录组测序、基因变达调控、转录因子结合位点的检测以及甲基化等研究领域都有应用。骨髓间充质干细胞(MSC)的功能缺陷可能导致衰老过程和年龄相关性疾病，如OP等〔15〕。通过HTS对患有OP疾病的病人进行MSC的分析，可以提高对OP发生、发展机制的更进一步的新认识。此外，第二代HTS技术在表观遗传水平的研究上也发挥着巨大作用。骨重塑是成骨细胞与破骨细胞的共同作用而产生的，DNA的甲基化在成骨细胞和破骨细胞的分化中起着重要作用。碱性磷酸酶(ALP)是由成骨细胞分泌的具有催化骨矿化作用的一种酶。研究表明，DNA的甲基化可抑制ALP在骨细胞中的表达〔16〕。在成骨细胞转移中，硬化蛋白编码基因(SOST)启动子区高甲基化可导致成骨细胞低表达〔17〕。此外，CPG岛的低甲基化也参与了成骨细胞分化过程的调控〔18〕。组蛋白修饰及染色质重塑在成骨细胞分化过程中也发挥了不可忽视的调节作用。破骨细胞是体内唯一的骨吸收细胞，DNA甲基化依赖机制可以通过影响人骨组织中的RANKL和OPG的基因转录参与破骨细胞分化的调控〔16〕。此外，组蛋白乙酰化也参与了破骨细胞的活性调节。随着HTS技术在RNA水平测序应用的发展，其在研究OP的发生、发展机制等方面也起着不可替代的作用。MSC在向成骨细胞分化的过程中，一些Micro RNA的表达水平变化会影响目的基因的转录，进而调控MSC的成骨分化过程〔19〕。一些体外实验表明，Micro RNA在破骨细胞生成及骨吸收过程中也发挥了正性调控作用〔20〕。Li等〔21〕在J Cell Mol Med 上发表的综述中提出以下假设：Micro RNA表达模式在物种进化中变异或者m RNA上Micro RNA结合位点的结构变异会有助于解释进化过程中物种间的颅面变化、人类颅面疾病的发展和年龄增长引起OP形成中的生理变化。因此，HTS技术在RNA水平的应用可为进一步探索OP疾病提供强大的技术支撑。

2.2 HTS技术在研究OP疾病中存在的问题 近年来，虽然HTS技术在测序通量、测序耗时和测序成本上都有了很大进步，但也有着局限性。首先，其测序后的海量测序数据的后期处理和分析也是一大难题。其次，虽然其测序成本大大降低，但对于一个小型实验室来说还是难以承受的。除此之外，与OP相关的单个基因具体功能尚未完全明了，限制了高通量测序在OP领域的跨越式发展研究。由于缺乏充足的动物实验，基因治疗在OP临床应用的安全性尚未阐明。

3 HTS技术在OP研究中的应用展望

随着人口老龄化的发展，老年人骨健康问题更为突出，患OP的患者越来越多，使其生活质量大大下降。HTS技术的出现，给OP等其他复杂疾病的研究提供了强大的技术支撑。随着精准医疗计划的提出，在医疗领域更加注重个性化。因此，对疾病的研究更大的挑战。从疾病的预测到预防到诊断到治疗护理及预后的评估等都做到个性化。从基因水平预测疾病的发生及疾病的易感性，然后做到更好地预防疾病发生。当疾病发生时应用更个体化的治疗，精准治疗可以大大减少治疗过程中的副作用。在疾病的护理方面也做到个性化护理。此外，在疾病的预后评估时给出更精准的评估以便给予更精准的后期指导。将精准医疗的概念应用到OP，将给OP患者带来福音。随着科学技术的不断发展和进步，HTS技术也在不断地发展，且发展速度非常之快，朝着更大通量更快速度和更低成本的方向在不断进步。此外，测序数据的分析技术也将不断地进步，相信在不久的将来HTS技术在OP及其他复杂疾病的研究中将起更大的推动作用。为精准医疗在OP中的应用提供技术支撑。OP早期的症状和体征不明显，缺乏特异性，故很难依据临床诊断标准来做出早期诊断〔22〕。HTS技术的发展将为预测、预防OP的发生和OP的早期诊断提供技术支撑，将为OP患者提供更精准的治疗，减少治疗的副作用，提供更恰当的护理方法，给出更精准的生活指导，将大大推动生命科学的发展和医疗卫生事业的进步。

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〔2016-08-30修回〕

(编辑 曲 莉)

国家自然科学基金资助项目(No.81272168);福建省自然科学基金资助项目(No.2016J01623)

陈 健(1963-)，男，博士，主任医师，硕士生导师，主要从事骨质疏松研究。

王 潇(1991-)，女，在读硕士，主要从事骨质疏松研究。

R681

A

1005-9202(2016)19-4915-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.116