张欢，赵赟鑫，高文，邓百万

(1.汉中市环境监测中心站，陕西 汉中 723000；2.汉中植物研究所，陕西 汉中 723000；3.陕西省食药用菌工程技术研究中心，陕西 汉中 723000；4.陕西理工学院 生物科学与工程学院，陕西 汉中 723000)

紫杉醇生产现状的分析与对策△

张欢1，赵赟鑫2*，高文2，3，邓百万3，4

(1.汉中市环境监测中心站，陕西 汉中723000；2.汉中植物研究所，陕西 汉中723000；3.陕西省食药用菌工程技术研究中心，陕西 汉中723000；4.陕西理工学院 生物科学与工程学院，陕西 汉中723000)

本文综述了目前生产紫杉醇的6种主要途径，通过分析各途径的特点，提出了利用内生真菌产紫杉醇有望解决市场上供不应求、价格昂贵的现状，且对于研究植物来源的天然药物新生产途径的开发及濒危药用植物的保护，具有十分重要的意义。

红豆杉；紫杉醇；内生真菌

红豆杉为红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属TaxusL.植物，在全世界有11种，分布于北半球的温带至亚热带地区[1]。中国有4种1变种，分别是红豆杉T.chinensisRehd.、东北红豆杉T.cuspidataSieb.et Zucc.、云南红豆杉T.yunnanensisChang et L.K.Fu、南方红豆杉T.chinensisvar.maireiChang et L.K.Fu、西藏红豆杉T.wallichianaZucc.[2]。红豆杉资源分布于我国各地，如华中、华东、华南、西南、东北、西北、西藏等地，但较集中的产区为东北、西南及华南地区。

美国化学家Wani MC和Wall首次从太平洋紫杉(短叶红豆杉T.brevifoliaNutt.)中分离出紫杉醇(Taxol)，并于1971年发表其化学结构[3]；Schiff 等[4]证实紫杉醇具备独特的抗癌机制；80年代美国和欧洲的科学家相继研究出紫杉醇的抗癌疗效[5]。

紫杉醇为白色结晶粉末，不溶于水，易溶于三氯甲烷、丙酮等有机溶剂，是由113个原子组成的三环二萜类化合物，分子式为C47H51NO14，相对分子量为853.92，熔点为213～216 ℃[6]。

由于紫杉醇在红豆杉中含量甚微，结构异常复杂，近年来研究紫杉醇的新来源成为世界性的热点。我国在红豆杉产紫杉醇的研究领域内已经取得了多项成果，但与世界先进国家相比还存在一定的差距，有待深入研究。目前，紫杉醇主要从以下几个方面来获得。

1 直接从红豆杉提取

目前，紫杉醇主要从红豆杉的树皮中进行提取，通过建立大量的栽培基地、培育和引进新品种来扩大红豆杉原料量。在国内除了栽培地方品种外，还引进曼地亚红豆杉及其他培育的新品种。近年来，很多地区开展了红豆杉扦插育苗技术的试验研究，并且已经获得了成功。中国科学院成都生物研究所于四川省茂县建立了大规模的中国红豆杉扦插育苗基地；云南林业部门与汉德公司合作，建立了826.7亩的云南红豆杉林，进行红豆杉的人工资源培育，苗木年产量达100万株以上；黑龙江省已经建成了数量超过552万株、栽培总面积达到4万亩的红豆杉人工林[7]。

然而，红豆杉资源依然非常缺乏，而且紫杉醇在红豆杉不同部位的含量均很低。植物树皮中紫杉醇的含量仅有0.01%，每提取1kg的紫杉醇就需要砍剥1000～2000棵树的树皮，但自从紫杉醇正式运用于临床后，每年约需200kg以上。据估计，为治疗一位卵巢癌患者，需消耗6棵树龄在60年以上的红豆杉大树。当前，全球每年消耗200kg紫杉醇，这就意味着需要砍伐100万棵红豆杉大树。随着紫杉醇应用范围的不断延伸，其需求量必然还会逐年上升，但是红豆杉树生长速度是相当缓慢的，直径20cm的树就需生长约100年[7]。因此，直接从红豆杉提取紫杉醇的途径不仅无法满足人们对紫杉醇的大量需求，而且还会严重破坏红豆杉的长期生存与分布。

2 化学半合成及全合成

2.1化学半合成

所谓半合成，是指从可再生的红豆杉树皮以及枝叶中，提取紫杉烷二萜类成分，其本身并无活性，以此为前体来合成紫杉醇。Denis等[8]首次研究报道了紫杉醇的半合成。紫杉醇半合成的主要前体是BaccatinⅢ与10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-deacetylbaccatinⅢ，10-DAB)。10-DAB在某些红豆杉品种的树皮以及枝叶中的含量是紫杉醇含量的3倍以上，以10-DAB作为合成的前体或起始物，从合成侧链开始到紫杉醇的合成仅需约10个步骤。

目前，生化半合成法是国际制药公司普遍采用的生产技术[9-10]。C13位侧链中间体与BaccatinⅢ 可以独立合成，并且水溶性较好，能够稳定存在。可利用生物酶类处理红豆杉原料，使BaccatinⅢ与C13位侧链中间体得到一定程度的富集，然后提取这些较易溶解的前体，最后将这些前体采用化学法或酶法合成为紫杉醇成品[11]。

紫杉醇半合成能在一定程度上改善紫杉醇供应短缺的情况，并且还可以使紫杉醇的侧链产生更大的可变性，有利于获得更高活性的紫杉醇衍生物[12]。但是，半合成法与直接从红豆杉的树皮中获取紫杉醇的方法并无本质上的区别，依然需要大量的半合成前体物质，依然需要消耗大量有机试剂和红豆杉树木，这些都制约了半合成法的推广。

2.2化学全合成

化学全合成是解决紫杉醇来源的理想途径，国内外有机合成化学家面临着全合成紫杉醇这一结构复杂的天然化学成分的巨大挑战。1993年，全世界从事此项工作的实验室就有50多个。1994年，由美国Holton研究组首先在实验室里成功地实现了化学法全合成紫杉醇。迄今为止，报道的紫杉醇全合成路线有三条：Holton路线[13]、Nicolaou路线[14]、Danishefsky路线[15]。

但是，由于紫杉醇有较多的手性基团，合成步骤多达20～25步，合成路线十分复杂，全合成难度较大，而且花费成本高，产率却很低，至今也没有在工业生产中应用。

3 植物细胞离体培养法

利用植物细胞和组织培养法生产紫杉醇已经成为当前紫杉醇药源开发的研究热点之一，这也是得到美国国家癌症研究所(NCI)投资的方向之一。国内外进行愈伤组织和细胞培养研究的红豆杉种及其变种超过10种，其中绝大部分都已证实可产生紫杉醇，选作诱导愈伤组织的外植体有根、茎、叶、树皮、形成层、假种皮、种子胚、幼苗胚轴、雌配子体等。

Christen首次采用红豆杉细胞悬浮培养技术生产紫杉醇[16]。1992年，在NCI主持的第二次紫杉醇研讨会上，ESCAgenetics公司宣布采用细胞悬浮培养法所得紫杉醇的含量是树皮的2至5倍；梅兴国等[17]研究了在两相培养的系统中红豆杉细胞的代谢与生长规律，其紫杉醇含量是30.19mg·L-1；甘烦远等[18]研究发现云南红豆杉细胞在发酵罐中的生长速率达到了12g·L-1，紫杉醇产量是成年红豆杉树皮中含量的12倍。

细胞离体培养生产紫杉醇的方法可完全摆脱对红豆杉的依赖，也摆脱了气候等环境因素的影响。而且细胞培养体系可方便地控制细胞的微环境，通过向培养基中添加抑制剂、诱导子和前体物质，能显著促进细胞内合成紫杉醇。但是该方法实现工业化生产的关键问题难以突破，植物细胞之间的不一致性、细胞生理与遗传的不稳定性导致在工业化培养过程中，高产细胞系不易实现高产率，而且易发生变异而产生其他代谢产物。除此之外，植物细胞培养技术较复杂，对反应器的要求比较高，在一定程度上阻碍了利用细胞培养来实现工业化生产紫杉醇。

4 基因工程

1994年，Han等[19]首次证明了农杆菌转化可用于红豆杉细胞，Plaut-Carcasson使红豆杉被发根农杆菌浸染后得到了发状根，再通过发状根培养获得了转基因植株，从而为目的基因转入红豆杉细胞奠定了良好的基础。

同时，通过了解紫杉醇生物合成途径及其催化酶的活性，特别是催化限速步骤的关键酶以及这些酶的编码基因，在分子水平对该途径实施人工操纵。现在已经发现紫杉醇生物合成的限速酶是紫杉二烯合成酶，而且紫杉二烯合成酶的基因分离和克隆已经成功。同时还分离了多种与紫杉醇合成代谢有关的酶类，并获得其cDNA克隆。这不仅进一步证明了合成紫杉醇的多个催化反应步骤，而且可以从分子水平对紫杉醇生物合成途径实施人工操纵，为提高紫杉醇合成量奠定基础[20]。王伟等[21]通过聚合酶链式反应(PCR)扩增同源探针，筛选cDNA文库，克隆了一个编码红豆杉(T.chinensisRehd.)的紫杉烯合酶3’端2151bp的cDNA片段，该酶与太平洋红豆杉的紫杉烯合酶有97%的同源性，所表达的融合蛋白以包含体的形式存在，利用组氨酸(His)残基亲和凝胶柱层析得到了融合的紫杉烯合酶，能够催化产生4(5)，11(12)-紫杉烯。

由于紫杉醇合成的详细步骤还不是十分的清楚，而且可能还由多个基因参与紫杉醇的合成，因此还需要更深入地研究红豆杉基因工程。

5 微生物转化法

微生物转化就是将与紫杉醇结构类似的一些紫杉烷类化合物，通过利用生物酶类的高度选择性转化成为紫杉醇的半合成前体，从而显著提高资源的利用率，并且简化了分离过程，提供一个解决紫杉醇来源问题的方法与思路。生物转化的反应类型主要包括[22]：环氧化反应、酰化反应、羟基化、重排、水解等。影响生物转化的因素主要有：底物的结构、底物的加入时间、加入底物的浓度、加入底物的方法以及培养基的pH等。

Zhang等[10]在云南红豆杉的树皮中分离纯化得到了80多株内生真菌，发现其中有3株具备转化为天然紫杉烷类化合物的能力。毛霉(Mucorsp.)和Microsphaeropsisonychiuri可使7位羟基差象异构化，并且水解10-deacetyl-7-epitaxol的13位侧链；而链格孢(Alternariaalternata)则可水解1β-hydroxy-baccatinⅠ的不同位置。此实验为微生物转化法生产紫杉醇提供了重要依据。

利用紫杉醇类似物之间的基因修饰获得更高活性的新化合物，应用领域十分广阔。目前，大部分生物转化工作还只是停滞在新反应的筛选和发现上，还未能实现工业化生产，因此需要更加深入地进行重要反应的研究。

6 微生物发酵法

1993年，美国化学家Stierle等[23]首次从短叶红豆杉Taxusbrevifolia的韧皮部分离获得了一种新的内生真菌Taxomycesandreanae，在半合成培养液中产生紫杉醇和紫杉烷类化合物。虽然此菌产紫杉醇含量很低，仅24～50ng·L-1，但说明了有些内生真菌能够合成与宿主植物相同或相似的活性成分。

随后，各国学者都围绕产紫杉醇的内生真菌来开展分离工作。Strobel等[24]从西藏红豆杉(T.wallachiana)中分离得到一株产紫杉醇的内生真菌，即小孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsismicrospora)，这种内生真菌的发酵液产紫杉醇的含量可达到50μg·L-1。之后又分离获得尼泊尔盘端鹿角菌Seimatoantleriumnepalense，其真菌发酵液产紫杉醇的含量为62～80ng·L-1[25]。

目前，除了在红豆杉属植物中分离得到产紫杉醇的内生真菌的研究有报道外，在一些非红豆杉属植物中也分离获得了产紫杉醇的内生真菌。Li等[26]从秃柏(Taxodiumdistichum)的树皮、木质部和韧皮部中分离得到了产紫杉醇的内生真菌Pestalotiopsismicrospora，这些研究进一步地扩大了筛选产紫杉醇内生真菌的范围。

我国学者也在积极开展分离筛选产紫杉醇内生真菌的研究。邱德友等[27]从云南红豆杉(T.yunnanensis)树皮中分离获得一种内生真菌YFI。采用薄层色谱(TLC)分析检测，结果表明，其可以产生紫杉醇，但是紫杉醇的产量很低。马天有等[28]从中国红豆杉树皮中分离获得一株内生真菌，其能够产生紫杉醇，产量是14.2μg·L-1。王伟等[29]从南方红豆杉(T.chinensisvarmairei)的主干和侧枝的树皮及韧皮部中分离获得了91株内生菌，其中有6株能产生紫杉烷类化合物，经鉴定分别属于轮柄梳霉属Martensiomycesspp.、头孢霉属Cephalosporiumspp.和无孢菌群Myceliasterlia。我课题组从秦巴山区野生红豆杉中分离获得了109株内生真菌。经过纯化获得了82株内生真菌。采用UV、HPLC和HPLC-MS检测方法，对82株内生真菌的发酵液中代谢产物进行检测，并通过形态学特性研究和内源转录间隔区(ITS)序列分析鉴定物种。结果表明，有8株内生真菌代谢产紫杉醇，其中有1株高产紫杉醇内生真菌LB-10，鉴定该菌株为绿僵菌Metarhiziumanisopliae，其紫杉醇含量为846.1μg·L-1[30]。

7 对策建议

7.1微生物发酵法的优势

笔者认为利用植物内生真菌作为药源是不会枯竭的，从可持续发展的角度来看，微生物发酵法具有以下6个优点：1)只需要采用一般的培养技术就能够培养微生物，采用的培养基配方简单；2)内生真菌生长速率高，易于缩短生产周期，易于分离和培养；3)微生物选育和育种速度明显高于植物细胞培养，易于通过诱变育种、基因工程等方法筛选高产菌株，从而提高紫杉醇的含量；4)微生物的培养与发酵条件相对比较容易掌握和控制，易于通过改进相关技术工艺、改善培养条件来提高产量；5)微生物作为工业生产的来源，通过在发酵罐中培养，可不断地进行目的代谢产物的生产；6)微生物发酵法易于扩大化，实验设备要求不高，有利于工业化大规模生产。

因此，利用微生物发酵法生产紫杉醇有望解决市场上价格昂贵、供不应求的现状，并且对于研究植物来源的天然药物新生产途径以及对濒危药用植物的保护，具有十分重要的意义。

7.2微生物发酵法存在的问题及对策

近几年来，红豆杉产紫杉醇的研究进展很快，国内外利用内生真菌产紫杉醇的研究报道逐渐增多。目前内生真菌产紫杉醇的含量普遍偏低，国内外学者也正在不断探索能够提高内生真菌产紫杉醇产量的途径。笔者认为主要存在两个方面的问题：一是缺乏高产、稳定的适于发酵的工业菌株；二是发酵条件的不合理，限制了单位发酵液中紫杉醇的含量。

为了筛选高产紫杉醇内生真菌并提高其产量，可以从以下几个方面入手：首先，以从自然界中获得高产菌株为目的，从野生红豆杉中分离筛选高产紫杉醇的内生真菌，并对其代谢产物进行定量检测；其次，利用诱变育种和基因工程技术对菌种进行改良，从而选育出高产、优质的菌株来提高紫杉醇的产量；第三，对已获得高产紫杉醇菌株的培养基组成和配比进行研究，优化碳源、氮源、微量元素的组成、浓度及其配比，同时筛选最佳的温度、pH值、接种量等发酵条件，这些能够在一定程度上提高紫杉醇的产量；最后，研究添加前体物质、诱导子和代谢抑制剂对真菌发酵合成紫杉醇的影响，筛选出对紫杉醇合成具有正效应的调节因子，确定其最适添加时间、浓度和配比，为工业化大生产提供理论依据。

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AnalysisandCountermeasuresofTaxolproductionStatus

ZHANGHuan1，ZHAOYunxin2*，GAOWen2，3，DENGBaiwan3，4

(1.HanzhongCityEnvironmentalMonitoringCenterStation，Hanzhong723000，China；2.Hanzhongresearchinstituteofbotany，Hanzhong723000，China；3.ShaanxiEngineeringResearchCenterofEdibleandMedicatedFungi，Hanzhong723000，China4.SchoolofBiologicalScienceandEngineering，ShaanxiUniversityofTechnology，Hanzhong723000，China)

The current six main ways of producing taxol are reviewed in this paper.By analyzing the characteristics of each way，we proposed that the use of endophytic fungi to produce taxol is expected to solve the market demand and expensive situation.It is also very important for the protection of endangered medicinal plants and development of new production way of natural medicine from plant origin.

Taxuschinensis；taxol；endophytic fungus

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.1.020

2014-07-04)

国家中医药公共卫生专项(201207002)；陕西省科学技术研究发展计划项目(2013K12-23-02)

*

赵赟鑫，硕士，研究方向：微生物次生代谢产活性物质研究；E-mail：alvin071625@hotmail.com