唐 静唐 伟谢明均*

（1 四川医科大学，四川 泸州 646000；2 游仙区人民医院，四川 绵阳 621004；3 宜宾市第一人民医院，四川 宜宾 644000）



干细胞诱导分化为肝样细胞检测技术的研究进展

唐 静1唐 伟2谢明均3*

（1 四川医科大学，四川 泸州 646000；2 游仙区人民医院，四川 绵阳 621004；3 宜宾市第一人民医院，四川 宜宾 644000）

【摘要】用于终末期肝病治疗的干细胞疗法是基础及临床研究的热点。而对干细胞诱导的肝样细胞进行肝细胞生物学功能检测是干细胞治疗的重要步骤。肝样细胞检测技术众多，需从中选出特异性强、灵敏度高、对细胞或机体影响小、方法简单易行的检测技术。本文通过对干细胞诱导分化的肝样细胞检测技术作一综述，为后期的实验提供一定的理论基础。

【关键词】干细胞；诱导；肝样细胞；检测

肝脏在机体中参与消化、代谢、免疫等生理过程。毒素、感染等因素可引起严重肝细胞损害，导致其合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍，最终发展至终末期肝病，严重威胁人类健康。原位肝移植是终末期肝病的有效治疗手段，但供肝紧缺及排斥反应限制了它的应用。干细胞是一类具有自我复制和多向分化潜能的细胞群体，在合适的条件下，可分化为具有特征性形态、特异分子标志和特殊功能的成熟细胞，如肝细胞、神经细胞、骨骼肌细胞、软骨细胞、血管内皮细胞、肺上皮细胞以及胰岛样细胞等[1]。

如今可通过向培养基中加入可溶性因子，如肝细胞生长因子（HGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、转化生长因子（TGF）等[2-3]，使干细胞向功能性肝样细胞分化。这些与细胞因子作用后表达的肝细胞特异性标志物可通过多种技术检测，而优选出特异性强、灵敏度高、对细胞或机体影响小、方法简单易行的检测技术是干细胞治疗的重中之重。本文通过对干细胞诱导分化为肝样细胞的检测技术作一综述，以寻求能高效检测肝样细胞的技术，保证诱导分化的肝样细胞在合成、代谢功能等方面对原代肝细胞进行替代，使得干细胞治疗安全、有效的应用于科研及临床。

1 干细胞诱导分化为肝样细胞的检测技术

1.1 RT-PCR：RT-PCR即逆转录-聚合酶链反应，是指对组织或细胞的的总RNA进行提取，把RNA反转录为cDNA，然后设计目的基因引物进行PCR，琼脂糖电泳并数码拍照，分析电泳条带灰度值，判断目的基因mRNA转录水平的相对量的变化。Robert E等[4]，Simon等[5]应用RT-PCR技术对干细胞诱导后细胞的AFP、ALB 、CK-18、G6PC、

1.2 Western Blot：Western Blot是根据抗原抗体的特异性结合检测样品中的特定蛋白的方法。其采用的是PAGE（聚丙烯酰氨凝胶电泳），经PAGE分离的蛋白样品，转移到固相载体，固相载体与蛋白质以非共价键连接，以连接的蛋白质或多肽作为抗原，与相应的特异性抗体结合，再与酶或同位素标记的二抗反应，对底物显色或放射自显影，通过分析着色的位置和着色深度了解特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况。Huang等[6]应用该技术在脐带干细胞诱导的肝样细胞检测出了与阳性对照一致的相对分子质量分别为67000、68000、55500 的ALB、AFP、CYP3A4条带。

1.3 免疫组织化学技术：免疫组织化学是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定细胞内抗原的成分（主要是多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。Zhang等[7]在人胎肝前体细胞诱导的肝样细胞中检测到ALB、AFP、AAT的表达，确定待检测细胞可表达肝细胞特异性基因。

1.4 ELISA：ELISA是酶联免疫吸附试验法的简称，其基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。通过洗涤将抗原抗体复合物与液相中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，通过反应结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据呈色的深浅进行定性或定量分析。Wang等[8]成功应用人ELISA定量装置在人造血干细胞诱导的细胞中检测出白蛋白的分泌，证实了人造血干细胞可诱导为有功能的肝样细胞。

1.5 流式细胞术：流式细胞术是用流式细胞仪测量液相中悬浮细胞或微粒的一种现代分析技术。如今，流式细胞术与单克隆抗体结合，可对细胞内抗原进行定性、定量检测[9]。用合适的固定剂及打孔剂对细胞固定打孔。利用抗原抗体特异性反应，将荧光染料（荧光探针）连接于不同的单克隆抗体，当细胞被激光器发射的激光照射后，胞质的抗原抗体复合物上的荧光探针可以发射出不同光谱的继发荧光，这些荧光通过流式细胞仪的识别和分辨，从而实现对细胞内抗原的定性、定量检测。Arefeh等[10]用流式细胞术检测到多功能干细胞诱导后细胞内白蛋白的合成，且表达白蛋白的细胞量已大于总细胞数的50%。

1.6 PAS染色检测糖原合成：PAS染色又称过碘酸雪夫氏染色，一般用来显示糖原和其他多糖物质。其原理是过碘酸的氧化作用使糖类及有关物质中的1、2-乙二醇基为二醛，醛与Schiff试剂（无色亚硫酸品红复合物）结合，形成紫红色反应产物而得到定位。Huang等[11]应用PAS染法对干细胞诱导后细胞内糖原进行检测，并证实了诱导成功的肝样细胞具有合成糖原的功能。

1.7 肝细胞极性分布的检测：细胞极化指细胞依据其生物功能的需要而产生的方向性和不对称性，具有极化特性的细胞膜分别面对不同的细胞外环境，并发挥不同的生物学功能。肝细胞是体内具有典型极化特征的细胞。肝细胞膜分为3个区域：面向肝血窦的基底侧膜、面向毛细胆管的顶膜、连接相邻肝细胞的侧膜。研究表明，极化肝细胞3个膜区中的蛋白质和脂质组成各不相同，基底侧膜的标志性蛋白包括Na依赖牛磺胆酸共转运多肽（NTCP）、低密度脂蛋白受体（LDLR）、多药耐药蛋白1，3，4，6（MDR1，3，4，6）、肝细胞生长因子受体（HGF-R）等；毛细胆管顶膜区包括多药耐受蛋白1，3（MDR1，3）、多耐药相关蛋白2（MRP2）和胆盐输出泵（BSEP）等；侧膜区有构成紧密连接的标志性蛋白ZO-1等和构成间隙连接的结构蛋白连接素等[12]。赵磊等[13]证实了干细胞诱导后的肝样细胞表达基底侧膜极化蛋白NTCP、SR-B1和MRP2，表明诱导成功的细胞已具有肝细胞极性。

1.8 尿素的检测：在氨基酸代谢过程中，有毒的氨在肝脏中经过鸟氨酸循环转变成无毒的尿素排出体外。尿素合成是成熟肝细胞清除血氨的主要途径。经干细胞诱导的细胞若具有合成尿素的功能，则证明诱导的肝样细胞已具有肝细胞的代谢功能。Zhang等[7]成功地运用生化分析仪在人胚胎肝祖细胞诱导分化的细胞中检测到尿素的生成，表明诱导后的肝样细胞已具备代谢氨的功能。Bao等[14]在进行无血清及间充质干细胞与大鼠肝细胞球混合培养的实验时，在培养基中加入重氨（15ND3），培养一段时间后，采用气相色谱分析/质谱分析法检测到富含氘（D）的重尿素的生成，同时采用尿素测试盒确定氨的清除随着尿素的生成的增多而减少，该检测不仅证实了体内氨的清除与尿素生成的关系密切，同时明确了同位素的应用更方便尿素的检测。在我们尚未发表的研究中也使用这一方法对诱导的肝样细胞尿素的来源进行检测。

1.9 构建肝细胞特异性表达载体：启动子作为基因调控序列的重要组成，在DNA转录成RNA的过程中，与转录调控因子相结合，与众调控序列及因子一起作用，实现真核生物基因组织特异性表达。目前研究表明，肝细胞中的ALB、AAT、细胞色素P450等基因所含有的肝脏特异性转录调控序列如启动子、增强子，可与肝脏富含的转录因子如HNF1、C/EBP及eH-TF等特异性结合，刺激基因仅在肝组织中高效转录[15]。将肝细胞特异性基因的启动子连接于报告基因的上游，构建病毒（如腺病毒、慢病毒等）或非病毒（如质粒）载体，转染干细胞，当干细胞向肝细胞分化时，启动子与转录因子结合，启动子被激活，调控报告基因的表达，报告基因的活性就间接反应了肝细胞特异性基因的表达水平，作为研究肝细胞成熟分化的一个检测手段。张维玉等[16]成功构建pBGLuc-ALB质粒，并分别将质粒转入肝系细胞与非肝系细胞中，同时检测培养上清中分泌的荧光素酶活性。结果显示荧光素酶活性：肝系细胞 >非肝系细胞，免疫荧光检测ALB含量与荧光素酶活性一致。该研究组进一步应用逆转录病毒成功构建稳定表达ALB-GLuc的肝干细胞株，诱导肝干细胞向肝样细胞分化，随着诱导时间的延长，细胞培养上清中荧光素酶表达逐渐增高，免疫荧光结果也显示ALB的表达越来越强，与荧光素酶活性增高的趋势一致。

2 总结与展望

对于肝样细胞的检测技术不必要逐个试验，可选用安全有效的技术对肝样细胞代谢、合成功能等方面进行检测，证实经干细胞成功诱导的肝样细胞具有肝细胞的特性，使得干细胞治疗安全、有效的应用于科研及临床。

我国是肝病大国，乙型肝炎尤其严重。此外，随着经济的发展、生活水平的提高以及环境污染的加剧，由酒精性、药物性以及免疫性因素等引发的肝病也在逐年增加。终末期肝病是各类肝病的晚期表现。肝移植是目前治疗终末期肝病的有效方法，但由于供体受限，限制了其发展。多年来，国内外学者致力于肝移植替代治疗的研究。自1999年Petersen等[17]发现骨髓中有干细胞具有向肝细胞分化的潜能以来，人们开始研究应用干细胞治疗肝脏疾病的可行性，后来发现不同来源的干细胞如骨髓间充质干细胞、脐血干细胞、脂肪干细胞等均可定向诱导分化为肝样细胞，具有正常肝细胞生物学功能，如合成糖

原、分泌尿素、白蛋白等，且得到动物实验的验证，临床亦有自体回输骨髓干细胞治疗肝病的报道。随着研究的增加，干细胞治疗为终末期肝病的治疗提供了一个新的方向。

应用细胞移植治疗肝脏疾病需要大量的、功能良好的肝样细胞，因此提供一条切实可行，经济方便的检测方法尤为重要。目前的检测方法，主要从合成白蛋白、糖原，分泌尿素及细胞色素P450功能等方面对诱导分化的肝样细胞进行检测。这些检测多在诱导分化过程结束后进行，并未对整个诱导分化过程进行监测。在肝细胞某些功能如储存脂溶性维生素A、D、E和K，叶酸，维生素B12，微量元素铜、铁等方面仍缺乏检测技术。体外诱导分化的肝样细胞要求能与在体的肝细胞生物学功能保持一致，才可能在接近生理的情况下用于研究干细胞移植、 生物人工肝供体等[18]。因此研究出特异性强、灵敏度高、对细胞或机体影响小、方法简单易行的检测技术是保证干细胞治疗有效、安全地用于基础及临床研究的重中之重。

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中图分类号：R329

文献标识码：A

文章编号：1671-8194（2016）07-0036-03

*通讯作者：E-mail：xiemingjun881@sina.cn