何荣军，赵月钧，赵瑞娜，孙培龙

(浙江工业大学 海洋学院，浙江 杭州 310014)



海葵免疫活性多糖的闪式提取工艺研究

何荣军，赵月钧，赵瑞娜，孙培龙

(浙江工业大学 海洋学院，浙江 杭州 310014)

摘要：在单因素实验的基础上，通过响应面分析法对星虫爱氏海葵多糖(SAP)的闪式提取工艺进行优化，并测定了海葵多糖的体外免疫活性.实验结果表明：海葵多糖的最佳提取工艺为剪切时间7 min，剪切温度40 ℃，液料比为10 mL/g，在此条件下海葵总糖得率为8.29%，接近理论多糖得率.提取的海葵多糖经30%，60%，80%乙醇醇沉，木瓜蛋白酶水解，Sevag试剂除蛋白后，所得组分均能显著提高THP-1细胞的TNF-α表达水平，30%醇沉部分(SAP30)的作用最为明显.

关键词：星虫爱氏海葵；多糖；闪式提取；免疫调节

海洋的特殊环境，促成海洋动物多糖结构与功能的多样性.目前已有大量研究结果表明：鲍鱼和海胆等海洋动物多糖具有增强免疫的生物活性[1-3].星虫爱氏海葵(Edwardsiasipunculoides)属于海葵(Sea anemone)的一种，沿海居民又称它为“涂蒜”，主要分布在我国的渤海、黄海和南海等海域，营埋栖息生活[4].有记载海葵具有抗肿瘤[5-6]，降压、抗菌、镇痛和中枢神经抑制[7]等作用.目前国内外对海葵的研究主要集中在其毒素的结构及生物活性方面，对于海葵多糖的研究报道相对稀少.郑淑贞等[8]首次对生长于我国南海西沙群岛的斯式花群海葵Zoanthusstephensoni化学成分进行了研究，同时他们研究发现该类海葵中提取的多糖具有明显的降压作用[9].

闪式提取是一种新型的天然产物提取技术，原料在高速剪切力和搅拌力作用下粉碎成细小颗粒，同时利用局部负压渗透作用让原料中的有效成分迅速扩散到溶剂中，在最短时间内达到溶解平衡[10].笔者主要从多糖的闪式提取工艺及其体外免疫作用的角度去研究海葵，为开发利用海葵资源提供一定的研究基础.

1材料与方法

1.1材料与试剂

本实验中的星虫爱氏海葵由浙江台州东经水产有限公司赠送.

RPMI 1640培养液、PBS和0.25%胰酶(吉诺生物医药有限公司)，二甲基亚砜(上海泽衡生物技术有限公司)，无支原体胎牛血清(浙江生物技术有限公司)，THP-1细胞(中科院上海细胞库)，TNF-α ELISA酶联免疫试剂盒(上海源叶生物技术有限公司)，3 U/mg木瓜蛋白酶(Sigma公司)，葡萄糖、苯酚、浓硫酸、正丁醇和氯仿均为国产分析纯试剂.

1.2主要仪器设备

GF-1型高速分散器(江苏海门市麒麟医用仪器厂)，DG5033A型酶联免疫测定仪(南京华东电子集团医疗装备有限责任公司).

1.3海葵多糖的提取

先将新鲜海葵剪碎，然后用组织剪切机将其打成匀浆液.取10 g海葵匀浆液加入一定量的水，放入GF-1型高速分散器中进行闪式剪切提取，提取液离心收集上清液，减压浓缩后用95%乙醇分级醇沉.取沉淀，用水溶解，加入粗多糖质量0.5%木瓜蛋白酶，55 ℃水解2 h，沸水浴5 min灭酶，再加入糖液三分之一体积的Sevag试剂，按照V(正丁醇)∶V(氯仿)=1∶4除蛋白，取水相真空冷冻干燥后得海葵多糖(SAP).

1.4总糖得率测定

采用苯酚-硫酸法测定响应面中海葵总糖得率[11-13]，即

总糖得率=

1.5海葵多糖对THP-1细胞产TNF-α的影响

将THP-1以1×105个/孔加入96孔板中，加质量浓度为62.5，125，250，500 μg/mL的待测多糖溶液，平行三组，培养48 h后，吸取细胞培养液上清100 μL，用ELISA试剂盒检测TNF-α.

2结果与讨论

2.1闪式提取单因素实验结果

2.1.1时间对总糖得率的影响

取10 g组织匀浆后的匀浆液，加入100 mL蒸馏水，离心速率为10 000 r/min，20 ℃剪切提取4，5，6，7，8 min，提取液经离心取上清液测总糖得率.图1(a)显示时间对总糖得率影响较大.随着时间的增加，总糖得率也随之增加，但当提取时间达到7 min后总糖得率趋于平缓.

2.1.2温度对总糖得率的影响

取10 g组织匀浆后的匀浆液，加入100 mL蒸馏水，离心速率10 000 r/min，分别在20，30，40，50，60 ℃剪切提取8 min，提取液经离心取上清液采用苯酚硫酸法测定吸光值，计算得到总糖得率.图1(b)显示总糖得率与提取温度呈正相关关系.当温度达到50 ℃时，总糖得率与60 ℃时的基本相同，因此，选择40，50，60 ℃为响应面因素温度的三个水平.

图1　提取条件对总糖得率的影响Fig.1　Effect of condition on extraction yield of polysaccharides

2.1.3液料比对总糖得率的影响

取10 g组织匀浆后的匀浆液，分别加入20，40，60，80，100 mL蒸馏水，离心速率为10 000 r/min，在20 ℃剪切提取8 min，提取液经离心取上清液采用苯酚硫酸法测定吸光值，计算得到总糖得率.图1(c)显示的是随着液料比的增加，总糖得率增加，当液料比达到6 mL/g时，总糖得率增加趋势有所变缓.

2.2闪式提取响应面分析实验结果

根据Box-Benhnken的中心组合计原理，根据单因素实验结果，选取提取时间、提取温度和液料比三个重要影响因素，以总糖得率为响应值Y，采用表1所示的试验因素水平设计进行响应面分析，实验结果见表2.

表1　响应面分析因素与水平

对实验数据进行回归拟合，得海葵多糖得率Y对于因素A，B，C的回归方程为

Y=8.10+0.25X1+0.055X2+0.57X3+

0.068X1X2+0.79X1X3-0.83X2X3-

1.48X1X1-0.79X2X2-0.77X3X3

(1)

利用F检验和p值对该模型的方差分析见表3.由表3中各模型的p值可知：式(1)中一次项时间和料液比为极显著因素，温度为不显著因素；式(1)中大部分二次项极显著；表明海葵多糖对各影响因素不是简单的线性关系.F值检验表明：该模型具有较高的F值(F=260.64)和较低的p值(p<0.000 1)，表明这个模型极显著.因此可以用该数学模型对闪式提取海葵多糖实验结果及最优条件进行分析和预测.

表2　响应面分析方案及实验结果

表3　回归方程各项的方差分析表

注：1)p<0.01为极显著**.

图2为闪式提取海葵多糖响应面曲面图.曲面图越对称两因素之间的交互作用越不明显[14].由此可知：在闪式提取海葵多糖试验中，时间和温度的交互作用不明显，而时间与液料比，温度和液料比之间的交互作用十分明显.为了进一步确定最佳值，根据对响应面图的分析及Design-Expert软件的优化分析，得到最佳提取条件：提取时间为7.28 min，温度为45.52 ℃，液料比为9.36 mL/g，海葵多糖理论得率为8.30%.为检验该法的可靠性，考虑到实际操作的便利，将最佳工艺参数修正为：提取时间7 min，温度为45 ℃，液料比为9 mL/g，进行多糖提取的验证试验，经3次平行试验，实际得率平均值为8.29%.可见实验结果与模型符合良好，说明该模型能较好地模拟和预测海葵多糖得率.

图2　各因素对总糖的交互影响曲面图Fig.2　Responsive surfaces of the interactive effects on polysaccharides

2.3海葵多糖对THP-1细胞产TNF-α的影响

采用苯酚-硫酸法对SAP30，SAP60和SAP80三个组分进行含量测定，结果显示SAP30组分总糖含量最高为95.61%，其次为SAP80组分88.27%，最后是SAP60组分87.06%.

TNF-α是由巨噬细胞在外来抗原刺激下产生的一种细胞因子，可直接杀死大部分肿瘤细胞，同时具有促进伤口愈合、血管生成等功效[15].采用62.5，125，250，500 μg/mL等的不同质量浓度与不同组分的海葵多糖刺激THP-1细胞来观察细TNF-α细胞因子的表达.图3显示海葵多糖能促进THP-1细胞分泌TNF-α的能力，具有剂量依赖性.且在相同质量浓度下，SAP30组分TNF-α细胞因子表达的量明显高于其它两个组分.

图3　海葵多糖对THP-1细胞产生TNF-α的影响Fig.3　Effect of SAP on THP 1 cells to produce the influence of TNF

3结论

本实验采用闪式提取海葵多糖的方法与传统的热水浸提法相比，不仅大大缩短了多糖的提取时间，在多糖得率方面因闪式提取方法可在常温或温度不高的水环境中提取多糖，可避免提取过程中海葵多糖与其蛋白质等发生美拉德反应，从而提高的海葵多糖的得率.通过响应面优化研究，得到海葵多糖提取最优工艺参数为提取时间7 min，温度为45 ℃，液料比为9 mL/g，在此条件下海葵多糖得率为8.29%.多糖作为重要的生物应答调节剂，对机体免疫具有重要的调节作用.本实验结果表明：从海葵中提取的不同组分多糖均能够促进THP-1细胞分泌抗肿瘤坏死因子TNF-α，其中SAP30组分对于促进TNF-α的表达效果明显优于其他两个组分.海葵多糖的免疫活性与其单糖组成、分子量大小和结构等都有密切关系，为阐明海葵多糖的免疫调节机制，在今后的工作中还需对其构效进行深入研究.

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(责任编辑：陈石平)

Study on optimizing homogenate extraction processing and immune

activityinvitroof polysaccharide from sea anemone

HE Rongjun, ZHAO Yuejun, ZHAO Ruina, SUN Peilong

(Ocean College, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014，China)

Abstract:Based on the single factor tests, the response surface methodology (RSM) was used for optimizing homogenate extraction processing of polysaccharide from Edwardsia sipunculoides (SAP). TNF-α of THP-1 cell stimulated by different concentractions of SAP30, SAP60 and SAP80 was detected by ELISA method. The results showed that the optimum extraction condition of polysaccharide from Edwardsia sipunculoides was as follows: 7 min homogenate extraction time, extraction temperature 40 ℃, and ratio of material to liquid 1∶10.Under the conditions, the extracting yield reached 8.29%. The study on immune activity in vitro showed that SAP could promote the concentration of TNF-α of THP-1 cell, while the effect of SAP30 was the most significant.

Keywords:Edwardsia sipunculoides; polysaccharide; homogenate extraction; immune activity

文章编号：1006-4303(2015)04-0389-04

中图分类号：Q819

文献标志码：A

作者简介：何荣军(1978—),男，浙江龙泉人，讲师，主要从事食品化学的研究，E-mail:hrjun@zjut.edu.cn.

基金项目：浙江省自然科学基金资助项目(LY12H28007)

收稿日期：2015-01-26