于 卓， 李 岩， 于肖夏， 闫文芝， 郝治满， 宋昌海， 姜 超

（1.内蒙古农业大学农学院， 呼和浩特010019；2.内蒙古巴彦淖尔市农牧业科学院， 内蒙古 巴彦淖尔015000）

马铃薯（Solanum tuberosumL.）是重要的粮菜兼用型作物，也是优良的饲料作物［1－2］。内蒙古地处北疆，海拔高，风速大，气候冷凉，日照充足，雨热同季，传毒媒介少，具有优越的生产马铃薯的自然环境条件，是我国马铃薯商品薯和种薯的重要产地之一，但近年来因马铃薯连作普遍、病害严重，导致该地区马铃薯产量和品质低下，亟待培育抗病抗性强、适应性广的马铃薯优良品种［3］。为培育抗病性强、品质好、产量高、薯型好的马铃薯新品种，根据优缺点互补和生态型差异大的亲本选配原则，用引自美国的广谱抗病性强的四倍体（2n＝4x＝48）野生马铃薯材料 YSP－4作母本，国内育成的产量高、品质好、抗晚疫病能力强的马铃薯品种陇薯7号作父本，人工去雄授粉杂交，成功获得YSP－4×陇薯7号杂种F1代群体，进而通过主要农艺性状观测和单株选择，选育出田间抗病性强、综合农艺性状优良的4个无性株系：株系3、株系5、株系6、株系12，其薯块各具特色［4］。

SSR（Simple Sequence Repeat）分子标记具有重复性好、多态性丰富和共显性的优点，已应用于植物的基因定位、杂种真实性鉴定、分子遗传连锁图谱构建及遗传多样性分析等方面［5－8］，本试验拟利用SSR分子标记技术对这4个优良株系进行DNA指纹鉴定，并分析评价其产量及营养品质，选出最佳的株系，旨在为育成马铃薯新品种提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料为YSP－4×陇薯7号杂交组合中选育出的优良株系3、株系5、株系6、株系12及其双亲，原种由内蒙古农业大学马铃薯育种研究中心提供。各材料的块茎特征如表1所示。

表1 供试材料的薯块特性

1.2 试验方法

1.2.1 试验地概况及种植方法

试验于2014年4—9月在呼和浩特市赛罕区内蒙古农业大学农场的网棚中进行，土壤为沙壤质栗钙土，pH＝8.0，肥力适中，具灌水条件。亲本和各杂种材料均采用单粒播种，种薯级别为原种，种植深度为12cm，株距为25cm，行距80cm，当植株长到15～20cm时进行中耕培土。以马铃薯专用复合肥作基肥，用量50 kg／667m2，并在块茎形成期一次性追施氮肥10kg／667m2，生长期间保证植株正常生长对水分的需求。

1.2.2 产量性状的测定

收获时，每个材料随机选取30个单株观测单株结薯数、单株块茎产量及单株商品薯率3个性状。其中，商品薯率用不同重量薯块的数量表示，即薯块重＜100g记为小薯，薯块重≥100g记为大中薯，商品薯率（%）＝大中薯数／单株结薯数×100%。

1.2.3 薯块营养品质性状的测定

收获后1周内，各株系选取重量为150～200g的薯块测定营养品质性状，主要包括干物质、淀粉、粗蛋白、还原糖、维生素C及酚类物质的含量。

干物质含量测定采用烘干法，重复3次，干物质含量（%）＝薯块的干重／薯块的鲜重×100%。用碘比色方法测定淀粉的含量，重复5次。用硝基水杨酸比色方法测定还原糖的含量，重复4次。用2，6－二氯靛酚滴定方法测定维生素C的含量，重复6次。粗蛋白测定采用双缩脲法，3次重复。酚类物质测定采用Folin－酚比色法，6次重复。各指标测定方法均参考张永成、田丰编著的《马铃薯试验研究方法》［9］。

1.2.4 SSR试验方法

1）DNA提取与检测：取各材料苗期的嫩叶，用基因组试剂盒提取其DNA（北京天根公司），其纯度用1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，将符合纯度要求的DNA置－20℃冰箱中备用。

2）SSR－PCR的反应体系和程序：体系为2.0μL的10×Buffer，0.225mmol／L 的 dNTPs 1.4μL，60ng／L的模板 DNA 1.0μL，1.5mmol／L 的 Mg2＋1μL，Taq DNA聚合酶0.09μL，0.5μmol／L的上下游引物各0.6μL，ddH2O 13.11μL。程序为94℃预变性4min，1个循环；94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸90s，共34个循环，最后72℃延伸10min，1个循环。扩增反应结束后，每个反应体系中加入6.0 μL的变性缓冲液，94℃变性处理5min后迅速取出冰浴冷却至室温［10］。

3）电泳和银染检测：扩增产物用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，上样量为5μL，时间为1.5h。将电泳后的胶板用蒸馏水漂洗2min，在染色液中银染12min，取出后蒸馏水速漂，显影液中显影至条带清晰时用蒸馏水漂洗2min，胶板在室内凉干后照相［11］。

4）引物的筛选：将公布在NCBI网站上的76对特异性马铃薯SSR引物，由上海生工有限公司合成碱基序列，以双亲的DNA作模板进行PCR扩增，从中选出条带稳定清晰、多态性良好的SSR适宜引物2对（表2），用于各杂种优良株系的SSR指纹鉴定［12］。

2 结果与分析

2.1 产量性状表现

各杂种株系的单株结薯数、单株产量和商品薯率存在一定差异（表3）。单株结薯数介于7.00～8.80个之间，以株系5较多，为8.80个，接近其父本陇薯7号。单株产量变幅为0.96～1.35kg，高低顺次为株系12＞株系6＞株系5＞株系3。各杂种株系单株的商品结薯率变幅为78.04%～93.14%，株系12的商品薯率最高，株系5最低。综合3项指标看，以株系12的产量性状表现最好，其次为株系6。

表2 适宜SSR引物及其碱基序列

表3 供试材料单株的结薯数、产量和商品薯率比较

2.2 营养品质性状表现

由表4可知，母本YSP－4的薯块干物质含量为23.07%，父本比母本高1.72%，差异显著。各杂种株系间的薯块干物质含量均存在一定差异，变幅为16.77%～24.85%，以株系6为最高，株系3次之，株系12再次之，株系5最低。

淀粉含量在各杂种株系间的变幅为12.27%～20.77%，株系6最高，为高淀粉株系；Vc含量在1.61～6.16mg／100g之间，以株系 12最高。还原糖含量变幅为0.018%～0.028%，均介于双亲之间，远低于马铃薯作为加工用不超过0.1%的要求，4个优良株系块茎的蛋白质含量变幅为0.97%～1.20%，以株系6最高。

马铃薯块茎中的酚类物质是重要的抗氧化剂，具有重要的保健功能。本试验结果表明，各杂种株系的酚类物质含量分布在0.35%～0.69%之间，差异显著，其中株系12最高、株系5最低。

从以上6项指标综合看，株系6的营养品质最好，且为高淀粉株系（≥20%）；其次为株系12。

2.3 SSR指纹差异

2.3.1 基因组DNA质量检测

4个杂种株系及其双亲的DNA电泳条带清晰稳定，无弥散及拖尾等现象，表明各材料的基因组DNA质量高，符合SSR标记分析对DNA纯度的要求（图1）。

图1 各材料基因组DNA纯度的电泳检测

2.3.2 SSR扩增结果

用筛选出的S 118和S 174这2对SSR适宜引物，对4个杂种株系及其双亲的基因组DNA进行PCR扩增，结果显示，2对引物共扩增出15个稳定清晰的SSR位点，每对引物平均为7.5个，其中多态性位点10个，多态性位点比率占66.67%（表5），表明6个供试材料间的遗传多态性较丰富。从图2可以看出，6个材料间的SSR指纹特征均有一定差异，每对引物都能清晰地识别出各杂种株系和其亲本，这为杂种株系鉴定及马铃薯新品种的育成登记提供了重要的DNA分子依据。

图2 6个材料用引物S 174和S 118扩增的SSR指纹图

表4 供试材料营养品质性状的比较

表5 2对引物对6个供试材料基因组DNA的SSR扩增结果

3 结 论

4个马铃薯杂种优良株系中，以株系12和株系6的产量及营养品质性状表现较为突出，分别为高产株系和高淀粉株系。

试验筛选出2对SSR适宜引物S 174和S 118，对6个材料PCR扩增得到10个多态性位点，其多态性位点百分率为66.67%；构建了能识别出4个马铃薯杂种株系和其亲本的SSR指纹图，为马铃薯新品种的育成和利用提供了分子依据。

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