乳腺癌循环肿瘤细胞分离鉴定试剂盒的建立

张健1，冯晓燕2，孙亭亭3，王凯4，张希锐3，高杰锋3，

梁晓飞4，康向东5，彭俊杰6，张贺秋2，苗朝良7，沈鹤柏3

(1.上海市临床检验中心，上海 2001262；2.军事医学科学院基础医学研究所生物诊断研究室，

北京 100850；3.上海柏慧康生物科技有限公司，上海 201900； 4.上海交通大学医学院附属

仁济医院上海市肿瘤研究所，上海 200032；5.上海市普陀区中心医院检验科，上海 200062；

6.复旦大学附属肿瘤医院大肠科，上海 200032；7.聊城市肿瘤医院，山东 聊城 252000)

摘要：目的探讨乳腺癌循环肿瘤细胞(CTC)分离鉴定试剂盒中上皮细胞黏附分子(EpCAM)免疫脂质磁球及人乳腺珠蛋白(hMAM)单克隆抗体在乳腺癌CTC分离鉴定中的应用价值。方法将乳腺癌MCF-7细胞混于健康志愿者的新鲜血样中，采用免疫磁球分离技术分析EpCAM免疫脂质磁球对乳腺癌细胞的分离效果。在强生CellTracks`(®) AutoPrep`(®) CTC检测仪(简称强生Cellsearch`(TM)系统)上进行EpCAM免疫脂质磁球和强生磁球对MCF-7细胞捕获效率的模拟实验及乳腺癌患者血液的临床检测。结果荧光显微镜的观察结果显示EpCAM免疫脂质磁球的细胞捕获能力明显强于无抗体修饰的纳米磁球。激光共聚焦显微镜的观察结果显示EpCAM抗体修饰可显著增强磁球捕获MCF-7细胞的效率和特异性。模拟实验结果显示EpCAM免疫脂质磁球对10、20、40、80、150、200个MCF-7细胞的捕获结果与强生磁球接近；对乳腺癌患者血液中的CTC捕获效率与强生磁球相当，部分病例要明显优于强生磁球。结论构建的基于EpCAM免疫脂质磁球和hMAM单克隆抗体的CTC分离鉴定试剂盒对乳腺癌患者血液中的CTC具有较高的捕获效率，这将为实现乳腺癌早期诊断、术前、术后分析及治疗效果检测提供了有力的支撑。

关键词：循环肿瘤细胞；上皮细胞黏附分子；免疫磁球；人乳腺珠蛋白

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)10-1011-06R446.1

文献标志码：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.10.012

基金项目：上海市科委生物医药产业处产学研项目(12DZ1941702)；上海市中小企业技术创新基金资助项目(1302H159400)；第2届中国创新创业大赛上海张江扶持资金资助项目

作者简介：张健，男，1970年生，主任技师，博士，主要从事免疫检验及质量控制。

Abstract:ObjectiveTo investigate the clinical application significance of epithelial cell adhesion molecule (EpCAM)lipid immune magnetic particles and human breast mammaglobin (hMAM) monoclonal antibody in breast cancer circulating tumor cell (CTC) isolation and identification kit. MethodsBreast cancer MCF-7 cells were mixed in healthy fresh blood samples, and the isolation ability of EpCAM lipid immune magnetic particles on breast cancer was analyzed by immune magnetic particle isolating technique. A comparison between EpCAM lipid immune magnetic particles and Cell Tracks® AutoPrep`(®) System (CellSearch`(TM)) magnetic particles for the capture efficiency of MCF-7 cells was performed in a simulation experiment, and the hematological items were determined. ResultsThe results of fluorescence microscopy showed that the capture ability of EpCAM lipid immune magnetic particle was significantly stronger than that of nanoparticles without antibody. The results of laser scanning confocal microscopy showed that the modification of EpCAM lipid immune magnetic particle antibody significantly enhanced the efficiency and specificity of magnetic particles capturing MCF-7 cells. Simulation experiment results showed that the capturing results of EpCAM lipid immune magnetic particles of 10, 20, 40, 80, 150 and 200 MCF-7 cells were close to CellSearch`(TM) magnetic particles. In the blood samples from patients with breast cancer, the CTC capturing efficiencies of EpCAM lipid immune magnetic particles and CellSearch`(TM) magnetic particles were almost the same, in some cases, the CTC capturing efficiency of EpCAM lipid immune magnetic particles was significantly better than that of CellSearch`(TM) magnetic particles. ConclusionsThe research on the establishment of EpCAM lipid immune magnetic particles and hMAN monoclonal antibody based on CTC isolation and identification kit has high capturing efficiency of CTC in blood samples from patients with breast cancer. It will provide a strong support for the early diagnosis, pre-operation and post-operation analysis and treatment effect evaluation.

收稿日期：(2015-04-07)

Establishment on isolation and identification kit for circulating tumor cells in breast cancerZHANGJian1,FENGXiaoyan2,SUNTingting3,WANGKai4,ZHANGXirui3,GAOJiefeng3,LIANGXiaofei4,KANGXiangdong5,PENGJunjie6,ZHANGHeqiu2，MIAOChaoliang7,SHENHebai3.(1.ShanghaiCenterforClinicalLaboratory,Shanghai200126,China; 2.BiologicalDiagnosticLaboratory,InstituteofBasicMedicine,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100850,China; 3.ShanghaiBaihuikangBio-Sci&TechCo.,Ltd.,Shanghai201900,China; 4.ShanghaiCancerInstitute,RenjiHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200032,China; 5.DepartmentofClinicalLaboratory,PutuoCentralHospital,Shanghai200062,China; 6.DepartmentofColorectalSurgery,ShanghaiCancerCenter,FudanUniversity,Shanghai200032,China; 7.LiaochengCancerHospital,ShandongLiaocheng252000,China)

Key words: Circulating tumor cell；Epithelial cell adhesion molecule；Immune magnetic particle；Human breast mammaglobin

迁移性是肿瘤的基本特征之一。肿瘤细胞在器官之间的转移是许多癌症致死的关键原因[1]。肿瘤组织活检、影像学检查等方法通常用于肿瘤的诊断及预后判断，但均有一定的滞后性，难以做到早期筛查[2]。近年来早期筛查主要针对未表现出症状的癌症患者，而这将增加癌症防治的成功率。美国国家癌症研究中心的统计数字表明早期筛查能使大肠癌的致死率至少下降60%，使肺癌的致死率下降20%[3]。

上皮细胞黏附分子(Epithelial cell adhesion molecules，EpCAM)在上皮癌变过程中发挥重要作用，在多数上皮来源的肿瘤细胞中过表达，而在中胚层来源的血细胞和淋巴细胞中不表达[4-7]。当前多数研究基于EpCAM来初步判定是否为循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)。人乳腺珠蛋白(human breast mammaglobin，hMAM)具有乳腺组织特异性，可应用于乳腺癌早期诊断、判断预后、微转移的检测等，具有很好的临床应用前景[8-12]。我们构建了基于EpCAM免疫脂质磁球和hMAM单克隆抗体的CTC分离鉴定试剂并进行了初步评价。

材料和方法

一、主要材料和仪器

乳腺癌细胞系MCF-7购自美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)细胞库；DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶购于美国赛默飞世尔公司；EpCAM抗体购于德国默克公司；藻红蛋白(phycoerythrin，PE)标记的CK 19抗体购自强生Veridex公司；hMAM单克隆抗体由北京军事医学科学院赠送；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色液购自碧云天生物技术有限公司；EpCAM抗体衍生物购自上海锐劲生物技术有限公司；磁性纳米颗粒购自上海晟纳实业有限公司；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSAPC-APCG)购自Avanti公司；胆固醇、二氯甲烷、及其它常用试剂均购自国药公司。磁力架购自上海柏慧康生物科技有限公司；OLYMPUS B 61荧光显微镜；PE标记的CD45抗体(CD45-PE)和BD FACSEALIBUR流式细胞仪均为美国BD公司生产；强生CellTracks®AutoPrep®CTC检测仪(简称强生CellsearchTM系统，强生Veridex公司)。

二、方法

1.乳腺癌CTC分离鉴定试剂盒的组装采用反向蒸发法制备EpCAM免疫脂质磁球，用粒径分析仪对EpCAM免疫脂质磁球进行粒径分析。乳腺癌CTC分离鉴定试剂盒的主要成分包括EpCAM免疫脂质磁球、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的hMAM单克隆抗体(hMAM-FITC)、DAPI染色液、CD45-PE、0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS；pH值7.4)、去离子水。乳腺癌CTC分离鉴定步骤：收集肿瘤患者7.5 mL抗凝血，1000×g离心10 min；小心取中上层液置于EP管中，加入与其等量的PBS充分混匀；加入免疫脂质磁球30 μL，室温孵育30 min，每10 min混匀1次；将EP管插入磁分离架上吸附5 min，吸弃上清液；PBS洗涤3次；加DAPI染色液30 μL、hMAM-FITC染色液10 μL、CD45-PE染色液10 μL混匀避光染色15 min；PBS洗涤3次；向EP管中加入30 μL 去离子水重悬，均匀涂于防脱载玻片，待液滴干后荧光显微镜下观察计数。

2. EpCAM免疫脂质磁球与纳米磁球的对比试验将计数后的1 000个MCF-7细胞分别放入7.5 mL PBS中，分别加入30 μL纳米磁球和EpCAM免疫脂质磁球，混匀后进行磁分离。经DAPI染色后制作细胞涂片，在荧光显微镜下观察并计数，计算磁球对MCF-7细胞的捕获效率。将制备的细胞涂片进行hMAM-FITC抗体染色，染色后采用激光共聚焦显微镜进一步观察细胞的形态大小。

3. EpCAM免疫脂质磁球捕获效率及hMAM-FITC染色效果检测取3只离心管，分别加入7.5 mL PBS，再分别加入10 000个MCF-7细胞和EpCAM免疫脂质磁球30 μL，混匀。作用20 min后以1 000×g离心10 min。小心将上清移入EP管中，置磁分离架上10 min后用PBS清洗3次。将EP管自磁分离架上取下分别标记为1号、2号、3号。1号不染色(对照组)，2号加入10 μL hMAM-FITC染色液，3号加20 μL hMAM-FITC染色液，室温避光染色15 min。染色结束后磁分离，用PBS洗3次，每次2 min。用BD FACSEALIBUR流式细胞仪分析MCF-7细胞荧光信息并统计细胞个数。

4.体外模拟循环肿瘤细胞的捕获实验按乳腺癌CTC分离鉴定步骤进行MCF-7细胞的磁分离操作，制作涂片，于荧光显微镜下观察计数。在7.5 mL健康供者的新鲜血样中分别加入10、40、80、150、200个MCF-7细胞，加入20 μL磁球后在强生CellsearchTM系统上进行分离鉴定，比较EpCAM免疫脂质磁球与强生磁球对MCF-7细胞的捕获效率。

5.CTC捕获与鉴定的临床应用为对比临床试验中自制EpCAM免疫脂质磁球与强生磁球的捕获效率的差异，将乳腺癌患者血样等分，每份7.5 mL，分别用EpCAM免疫脂质磁球和强生磁球在强生CellsearchTM系统上进行临床样本分析。同时按乳腺癌CTC分离鉴定步骤检测多例乳腺癌患者样本，并与其临床其它检查指标综合分析，为临床医生判断治疗效果提供依据。

结果

一、EpCAM修饰后免疫脂质磁球粒径变化

纳米磁球在未经EpCAM抗体修饰前的平均粒径为(143.7±0.5)nm[见图1(a)]，经EpCAM抗体修饰后的免疫脂质磁球平均粒径为(192.1 ±0.7)nm[见图1(b)]。较小的粒径有助于抗体磁球保持在水相溶液中的稳定性，本研究制备的抗体磁球满足预期要求。

注：(a)未经EpCAM抗体修饰的磁球粒径分布；(b)经EpCAM抗体修饰后的磁球粒径分布 图1　磁球粒径分布

二、EpCAM免疫脂质磁球与纳米磁球对比试验

在荧光显微镜下比较纳米磁球和EpCAM免疫脂质磁球对MCF-7细胞的捕获能力。结果显示EpCAM免疫脂质磁球的细胞捕获能力明显强于没有抗体修饰的纳米磁球，见图2。

注：(a)未修饰纳米磁球的粒径分布；(b)EpCAM免疫脂质磁球修饰粒径分布 图2　纳米磁球和EpCAM免疫脂质磁球捕获MCF-7细胞能力对比

在激光共聚焦显微镜下，EpCAM免疫脂质磁球捕获的细胞因与hMAM-FITC结合发出绿色荧光；纳米磁球捕获的细胞不显示绿色荧光，提示所捕获细胞可能为非特异性结合的血液细胞。见图3。EpCAM抗体修饰可显著增强磁球捕获MCF-7细胞的效率和特异性。

注： WF为白场(white field)；Merge为DAPI及FITC-hMAM的叠加 图3　纳米磁球和EpCAM免疫脂质磁球捕获MCF-7细胞的激光共聚焦显微镜分析

三、EpCAM免疫脂质磁球捕获效率检测

BD FACSEALIBUR流式细胞仪分析的10 000个细胞中大约有7 790～8 010个细胞为MCF-7细胞。对照组(不染色)、10 μL hMAM-FITC染色组和20 μL hMAM-FITC染色组的MCF-7细胞捕获率较为接近，均值为79%。见图4。

图5(a)～图5(c)显示了对照组(不染色)、10 μL hMAM-FITC染色组和20 μL hMAM-FITC染色组框选的细胞的荧光值相对强度。对照组MCF-7细胞的背景荧光强度中位数为2.92[见图5(e)]；采用hMAM-FITC染色的2个组随着抗体用量的增加，荧光强度(中位数)分别升高5.8倍和12.4倍[见图5(e)]。表明hMAM-FITC的用量可影响MCF-7细胞的染色效果。

注：(a)对照组(不染色)；(b)10 μL hMAM-FITC染色组；(c)20 μL hMAM-FITC染色组 图4　EpCAM免疫脂质磁球捕获MCF-7细胞的流式细胞术分析

注：(a)对照组(不染色)；(b)10 μL hMAM-FITC染色组；(c)20 μL hMAM-FITC染色组；(d)荧光信号强度比较；(e)荧光信号分析 图5　EpCAM免疫脂质磁球捕获MCF-7细胞的流式荧光信号分析

四、模拟研究循环肿瘤细胞捕获与鉴定

EpCAM免疫脂质磁球在检出的细胞形态、染色状况接近于强生磁球检出的细胞，见图6(a)。模拟实验显示EpCAM免疫脂质磁球对10、20、40、80、150、200个MCF-7细胞的捕获结果与强生磁球接近，见图6(b)。EpCAM免疫脂质磁球具有较为理想的乳腺癌细胞捕获能力。

五、临床研究循环肿瘤细胞捕获与鉴定

强生CellsearchTM系统的临床检测结果见图7(a)，对临床血样的捕获CTC成像结果显示EpCAM免疫脂质磁球与强生磁球近似。对3例乳腺癌患者血样的检测结果见图7(b)A1～A3。

注：(a)细胞形态比较；(b)细胞数量统计 图6　EpCAM免疫脂质磁球与强生磁球捕获MCF-7细胞总数的对比

注：(a)强生磁球和EpCAM免疫脂质磁球捕获的临床血液样品中CTC的形态；(b)强生磁球和EpCAM免疫脂质磁球对临床血液样本的检查结果，A1～A3为乳腺癌患者，B1～B6为疑似乳腺癌患者，C1～C3为健康女性 图7　强生磁球与EpCAM免疫脂质磁球捕获临床血样中CTC的对比

EpCAM免疫脂质磁球对1、2号患者的CTC检出量明显高于强生磁球，对3号患者的检出量也高于强生磁球。EpCAM免疫脂质磁球对6例疑似乳腺癌患者和3名健康女性血液进行CTC检测的结果见图7(b)B1～B6、C1～C3，其中3名健康女性的CTC检测结果分别为0、0、1个，说明EpCAM免疫脂质磁球具有较低的假阳性率；6例疑似乳腺癌患者的CTC检测结果分别为0、2、8、28、121、93个。EpCAM免疫脂质磁球具有较高的CTC检出率和较低的假阳性率。

采用EpCAM免疫脂质磁球构建乳腺癌CTC分离鉴定试剂盒，手工操作捕获乳腺癌患者血液中的CTC并在荧光显微镜下观察。乳腺癌CTC被hMAM-FITC抗体染色显绿色，同时DAPI染色为蓝色荧光，CD45染色不显示荧光，综合判断为乳腺癌阳性细胞。见图8。

注：放大倍数为×400 图8　EpCAM免疫脂质磁球捕获乳腺癌临床血样中CTC的免疫荧光观察

讨论

癌症患者血液中存在CTC最早报道于1869年。癌症早期阶段CTC的数量是非常少的，每1 mL血液中CTC数量一般低于100个，正常血液细胞的数量一般多于109个[13]。近年来，探测、分离多个器官来源的CTC的方法不断发展，使CTC的连续检测成为可能。微流控芯片技术增强了血液中的CTC与基质固定的抗体之间的结合效率。当前检测CTC的技术主要包括基于免疫磁分离技术捕获血液中的CTC、基于癌细胞远大于正常血液细胞而设计的微芯片分离技术等方法[14-19]。

当前多数免疫磁球法常以EpCAM抗体的磁球来捕获富集CTC。hMAM是WATSON等1996年首次在乳腺癌组织中发现的，只在乳腺上皮细胞中表达，并在乳腺癌细胞中过表达。hMAMmRNA 在乳腺癌患者的外周血、骨髓、胸腔积液中的阳性表达提示乳腺癌的转移和不良预后。因此，hMAM可作为一种潜在的采用血液学方法检测乳腺癌患者CTC的标志物。

本研究构建的基于EpCAM免疫脂质磁球和hMAM的CTC分离鉴定试剂盒对乳腺癌患者血液中的CTC具有较高的捕获效率，手工操作能有效俘获乳腺癌患者血液中的CTC，染色效果清晰可辨识。但该方法对乳腺癌早期诊断、术前、术后分析及治疗效果评估需进行更大样本量的研究证实。

参考文献

[1]BOGEMANN M. Circulating tumor cells (Ctc) as biomarkers in recurrent and castration resistant prostate cancer[J]. Anticancer Research，2014，34(11): 6802.

[2]THEIL G，WENCKER A，KERSTEN F，et al. Verification of a functionalized structured medical wire for the isolation of circulating tumor cells (Ctc) in patients with renal cell carcinoma[J]. Journal of Urology，2013，189(4): E192.

[3]RAWLUK J，PANTIC M，KLEBER M，et al. Striking，aggressive synchronous non-small cell lung cancer (NSCLC) in a multiple myeloma (MM) patient (pt) and circulating tumor cell (CTC) detection[J]. Onkologie，2013，36: 255.

[4]YAMADA T，KURAMITSU K，RIKITSU E，et al. Nectin and junctional adhesion molecule are critical cell adhesion molecules for the apico-basal alignment of adherens and tight junctions in epithelial cells[J]. Genes Cells，2013，18(11): 985-998.

[6]STREECK H，KWON DS，PYO A，et al. Epithelial adhesion molecules can inhibit HIV-1-specific CD8+T-cell functions[J]. Blood，2011，117(19): 5112-5122.

[7]OH JH，PARK EJ，PARK JW，et al. A novel cyclin-dependent kinase inhibitor down-regulates tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha)-induced expression of cell adhesion molecules by inhibition of NF-kappaB activation in human pulmonary epithelial cells[J]. Int Immunopharmacol，2010，10(5): 572-579.

[8]AL JOUDI FS. Human mammaglobin in breast cancer: a brief review of its clinical utility[J]. Indian J Med Res，2014，139(5): 675-685.

[9]XU X，WENG X，LIU A，et al. Electrochemical genosensor for detection of human mammaglobin in polymerase chain reaction amplification products of breast cancer patients[J]. Anal Bioanal Chem，2013，405(10): 3097-3103.

[10]LIU Y，MA L，LIU X，et al. Expression of human mammaglobin as a marker of bone marrow micrometastasis in breast cancer[J]. Exp Ther Med，2012，3(3): 550-554.

[11]LI G，ZHANG J，JIN K，et al. Human mammaglobin: a superior marker for reverse-transcriptase PCR in detecting circulating tumor cells in breast cancer patients[J]. Biomark Med，2011，5(2): 249-260.

[12]DONO M，FERRO P，FRANCESCHINI MC，et al. Human mammaglobin transcript amplification for differential diagnosis in a breast cancer metastatic to dura mater[J]. Anticancer Res，2011，31(3): 1061-1064.

[13]AOKI N，MATSUDA T，SAITO H，et al. A comparative double-blind randomized trial of activated protein C and unfractionated heparin in the treatment of disseminated intravascular coagulation[J]. Int J Hematol，2002，75(5): 540-547.

[14]JU M，KAO GD，STEINMETZ D，et al. Application of a telomerase-based circulating tumor cell (CTC) assay in bladder cancer patients receiving postoperative radiation therapy: a case study[J]. Cancer Biol Ther，2014，15(6): 683-687.

[15]NERI E，MANG T，HELLSTROM M，et al. How to read and report CTC[J]. Eur J Radiol，2013，82(8): 1166-1170.

[16]LU YT，ZHAO L，SHEN Q，et al. NanoVelcro Chip for CTC enumeration in prostate cancer patients[J]. Methods，2013，64(2): 144-152.

[17]BHUYAN LP，SABHAPONDIT S，BARUAH BD，et al. Polyphenolic compounds and antioxidant activity of CTC black tea of North-East India[J]. Food Chem，2013，141(4): 3744-3751.

[18]ALBINO G，VENDITTELLI F，PAOLILLO C，et al. Potential usefulness of CTC detection in follow up of prostate cancer patients. A preliminary report obtained by using Adnagene platform [J]. Arch Ital Urol Androl，2013，85(4): 164-169.

[19]ZHENG S，LIN HK，LU B，et al. 3D microfilter device for viable circulating tumor cell (CTC) enrichment from blood[J]. Biomed Microdevices，2011，13(1): 203-213.

(本文编辑：龚晓霖)