ABO血型基因分型在白血病患儿疑难血型鉴定中的应用

叶星晨，张帆，顾玉微，傅启华，王静

(上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心检验科，上海 200127)

摘要：目的将基因分型技术应用于白血病患儿的疑难血型鉴定中，有效避免疾病等外在因素的干扰，准确鉴定ABO血型，保障患者的输血安全。方法ABO血型血清学鉴定采用微柱凝胶法。提取全血DNA，利用聚合酶链反应(PCR)扩增ABO基因 1~7号外显子、增强子和启动子区序列，进行直接测序，测序结果与血型基因变异位点数据库(Blood Group Antigen Gene Mutation Database)比较，进行ABO血型基因分型。结果1例患儿血清学实验结果可能为A亚型，基因分型结果为A102/O01，确认为A型。另1例患儿血清学实验结果可能为B亚型，基因分型结果为B101/O01，确认为B型。2例患者均输注相应血型红细胞制品，无任何不良反应。结论该2例患儿因疾病造成ABO血清学鉴定正反定型不符，血型难以鉴定，应用ABO血型基因分型技术则能准确鉴定患者的血型，保证输血安全、有效。

关键词：ABO 血型；基因型；表现型；疑难血型

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)10-0993-05R446.1

文献标志码：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.10.007

Abstract:ObjectiveTo identify type discrepancy blood accurately by applying genotyping technique in leukemia children for ABO blood type identification, avoiding the interference of disease and other factors, ensuring transfusion safety. MethodsMicro-column agglutination was used for ABO blood type serological identification. The DNA was extracted from whole blood of leukemia children. Exon 1-7, enhancer and promoter regions of ABO gene were amplified by polymerase chain reaction(PCR). PCR products were directly sequenced， and the results were compared with those of the Blood Group Antigen Gene Mutation Database to identify ABO genotyping. ResultsThe serological result of 1 leukemia children might be subgroup A, genotype A102/O01, so it was identified as A blood type. The another serological result might be subgroup B, genotype B101/O01, so it was identified as B blood type. Red cell products of compatible blood type were transfused to the 2 patients without any adverse reaction. ConclusionsThe results of forward and reverse tests for the 2 children are not accordant because of diseases, which make us hard to identify blood type. However, it helps us with ensuring the transfusion safety and effectivity by ABO genotyping technique.

作者简介：叶星晨，女，1989年生，学士，主要从事临床输血工作及相关方向研究 。

通讯作者：王静，联系电话：021-38625548。

收稿日期：(2014-12-15)

Application of ABO genotyping in the identification of type discrepancy blood in children with leukemiaYEXingchen,ZHANGFan,GUYuwei,FUQihua,WANGJing.(DepartmentofClinicalLaboratory,ShanghaiChildren′sMedicalCenter,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200127,China)

Key words: ABO blood type; Genotype; Phenotype; Discrepancy blood type

有关白血病患者血型抗原减弱或抗体效价降低的报道并不少见，临床上应用常规血清学血型鉴定时往往容易发生误判而影响临床输血安全。白血病患者血型抗原弱化这一现象的真正原因目前还不甚明了。血型基因分型，不仅可以避免疾病、输血等外在因素对血型鉴定的干扰，还可能从分子水平上分析血型抗原变化的原因，准确鉴定患者的血型，以保障输血安全、有效。我们应用ABO血型基因分型技术，对2例白血病患儿疑难血型进行了鉴定。

材料和方法

一、研究对象

2例白血病患儿均为上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心血液肿瘤科住院治疗患者。病例1为14岁患儿，男性，临床诊断为急性非淋巴细胞白血病(M2b)。病例2为2岁患儿，临床诊断为非霍奇金淋巴瘤。输血前血清学血型鉴定均为正反定型不符，血培养结果及输血传染病指标检查均为阴性。

二、方法

1. 标本采集采集患者静脉血标本，以0.109 mol/L柠檬酸钠1∶9抗凝，用于抽提DNA，-80℃冻存。

2.仪器与试剂WADiana/8XT 全自动血型仪、DG Gel Confirm卡、DG Gel Neutral卡及DG Gel Coombs卡为西班牙Diagnostic Grifols S.A公司产品。抗球蛋白试剂、单克隆抗A抗体、单克隆抗B抗体、人源抗A抗体、人源抗B抗体、单克隆抗H抗体、人ABO血型反定型用红细胞试剂盒、抗体筛查细胞为上海血液生物医药有限责任公司产品。快速抽提血液基因组试剂盒(Rapid Blood Genomic DNA Isolation Kit)为上海生工生物有限公司产品；引物设计参照美国国立生物信息中心(the National Center for Biotechnology Information，NCBI)基因库(GenBank)中ABO基因序列(序列号FR828573.1)，由华大基因公司合成，序列见表1。聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR) 扩增试剂为C-TaKaRa(大连宝生物) 公司产品。仪器为Bio-rad C1000Thermal Cycle PCR扩增仪。

表1　ABO血型基因分型引物序列

3. 血型血清学实验(1)微柱凝胶法：进行ABO血型鉴定、直接和间接抗人球蛋白试验、抗体筛查;(2)试管法：进行H抗原鉴定、人源性A抗原和B抗原鉴定。试验方法参照文献[1]进行。

4. 血型基因分型从患者全血中提取基因组DNA，利用PCR扩增ABO1~7号外显子、增强子和启动子区序列。总反应体系为25 μL，其中Taq DNA 聚合酶(5 U/μL) 0.2 μL，10 reaction buffer 2.5 μL，dNTP mix (10 mmol/μL) 2 μL，上下游引物(10 mmol/μL)各1μL，DNA模板 1 μL以及ddH2O 17.3 μL。扩增条件：95 ℃ 5 min后95 ℃ 变性30 s，62℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s， 35个循环后 72 ℃ 5 min。反应产物由华大基因公司测序。测序结果与血型基因变异位点数据库(Blood Group Antigen Gene Mutation Database)比对，以A101为标准序列判断其血型基因型。

结果

一、血型血清学实验结果

患儿1红细胞在微柱凝胶法中与单克隆抗A抗体反应为双群，与单克隆抗B抗体反应呈阴性；试管法中与单克隆抗H抗体反应为阳性，与人源性抗A抗体反应为混合视野，与人源性抗B抗体反应为阴性。其血清不凝集A1型和O型标准红细胞，与B型红细胞凝集呈强阳性。该实验对照为正常A型红细胞及血清。因此该患儿血清学定型可能为A亚型。患儿2红细胞在微柱凝胶法中与单克隆抗A抗体反应呈阴性，与单克隆抗B抗体反应为双群；试管法中与单克隆抗H抗体反应为阳性，与人源性抗A反应为阴性，与人源性抗B抗体反应为混合视野。其血清不凝集B型和O型标准红细胞，与A1型红细胞凝集呈强阳性。该实验对照为正常B型红细胞及血清。因此该患儿血清学定型可能为B亚型。见表2。直接及间接抗球蛋白试验均阴性，抗体筛查均阴性。

表2　2例白血病患儿的血清学血型鉴定结果

二、ABO血型基因分型结果

分别对2例患儿ABO基因1~7号外显子、增强子以及启动子区域进行PCR扩增及测序，结果参照Blood Group Antigen Gene Mutation Database，以A101为标准序列进行比对。患儿1的6号外显子存在261delG变异，7号外显子存在467C>T变异，在其余外显子以及增强子和启动子中未发现变异。由467C>T判断基因型为A102，由261delG判断基因型为O01，因此该患儿ABO基因分型结果为A102/O01。患儿2的6号外显子存在261delG、297A>G变异，7号外显子存在526C>G、657C>T、703G>A、796C>A、830G>C、930G>A变异，其余外显子以及增强子和启动子中未发现变异。由261delG判断基因型为O01，其余点突变判断基因型为B101。该患儿ABO 基因分型结果为B101/O01。见表3、图1。

表3　2例白血病患儿的基因分型结果

讨论

有关疾病引起血型抗原变化或抗体效价降低的报道并不少见，其中尤以白血病居多[2-8]。有学者认为，ABO血型基因变异是造成患者血型抗原变化的真正原因[9-11]。正如许多肿瘤疾病都与病毒相关，且人类病毒致癌基因c-abl就位于9号染色体q34位点，肿瘤患者的ABO血型基因很有可能受到病毒基因干扰，而使血型抗原物质的合成受到阻断。NOVARETTI等[12]分析了108例不同类型白血病患者的ABO血型基因，在其中的25例患者中发现了22个新的ABO等位基因突变型，包括11个单核苷酸突变、12个单碱基插入、6个单碱基缺失和1个相互易位。可见白血病等肿瘤疾病的患者随着病程的发展确实会引起ABO基因的变异。除此之外，疾病的发生、发展不仅仅引起ABO基因编码区的突变，更多的是对ABO调控基因的影响[9]。BIANCO-MIOTTO等[13]认为白血病患者血型抗原减弱与启动子甲基化关系密切。生理情况下，启动子上的CpG岛一般为非甲基化状态。但当机体发生癌变，CpG岛甲基化程度随之变化，从而影响ABO基因的转录表达[14]。CHIHARA等[15]在对膀胱癌患者ABO抗原减弱的研究中发现，随着患者ABO基因启动子上CpG岛甲基化位置和数目的不同，抗原改变情况亦有不同。

本研究所涉及的2名患儿血清学血型鉴定结果分别为疑似A亚型和疑似B亚型，而他们的

注：图a、b、c为样本1测序结果，图a、b箭头所示为第6显子261delG杂合缺失，a为正向测序，b为反向测序，图c箭头所示为第7外显子467C>T杂合变异，图d、e、f、g、h、i、j、k为样本2测序结果，图d、e箭头所示为第6显子261delG杂合缺失，d为正向测序，e为反向测序；图f箭头所示为第6外显子297A>G杂合变异(反向)；图g箭头所示为第7外显子526C>G杂合变异；图h箭头所示为第7外显子657C>T杂合变异；图i箭头所示为第7外显子703G>A杂合变异；图j箭头所示为第7外显子796C>A和803G>C杂合变异；图k箭头所示为第7外显子930G>A杂合变异 图1　2例患儿ABO血型基因测序结果

ABO血型基因型分别为正常A型和B型。然而该2名白血病患儿的基因分型结果与以上报道有所不同，两者ABO基因外显子区域并没有发生新的等位基因变异，且在调控区序列中亦未发现突变，可见其抗原减弱并非由于基因变异引起。血清学实验中H抗原检测正常，则显示并非由于粒系病理性增殖而导致红系增生受抑引起的血型抗原的减弱。因此，本研究推测可能是由于在癌变的过程中，A、B抗原的糖基转移酶活性降低，导致部分A、B抗原合成减少。除排除基因变异引起酶活性降低的可能性之外，还可能是肿瘤细胞的干扰作用，或是由于ABO基因启动子甲基化影响了基因的正常转录。我们对这2名患儿作了随访，发现其中的弱A型患儿随着白血病病情缓解，其A抗原强度恢复正常；另1例弱B患儿病情一直未得到缓解，经救治无效死亡，在院期间多次血清学血型鉴定均显示B抗原弱表达。

在对疾病引起血型抗原弱化的研究中，还有部分学者则认为白血病患者血型抗原减弱这种现象既没有从根本上改变红细胞表面抗原的表达，也不涉及血型基因的变异，是由于红系增生抑制，代谢受到干扰，AB抗原相对减少。或是由于肿瘤细胞降低了AB抗原特异性糖基转移酶的活性，导致血型抗原活性的减弱。体内唾液黏蛋白产生过多，黏附和遮蔽红细胞表面抗原表位亦可导致血型变异，但这种黏蛋白对唾液中的血型物质鉴定影响更大[16]。

ABO血型抗原与白血病的关系已日渐成为研究热点。TAVASOLIAN等[17]的研究结果显示在急性淋巴细胞白血病和慢性髓细胞白血病患者中4种不同ABO血型分布差异有统计学差异。而BIANCO-MIOTTO等[13]运用流式细胞术发现约55%的骨髓恶性肿瘤患者由于受疾病干扰影响使得红细胞表面ABO抗原发生了变化。由于两者内在的紧密联系，因此一直以来专家学者们都认为对血型抗原的研究是白血病病因机制探索的一项有效策略。

血液病患者尤其是儿童血液病患者这一特殊群体的输血安全问题，无疑是备受广泛关注的。许多恶性血液病患者都需要长期输血支持，而红细胞同种免疫则正是引起长期输血患者急性溶血和输血有效率降低的主要问题，SANZ等[18]报道约15%的骨髓增生异常综合征或慢性单核细胞白血病患者长期输血后会发生红细胞同种免疫而产生自身抗体。面对这一难题，首先则必须保证对患者的血型作出准确定型，输注同型血液制品，才能将患者的输注风险降至最低。

综上所述，血清学血型鉴定会受到疾病、类血型物质、黏液蛋白等多种原因的影响，造成结果难以判断，但基因分型技术不受这些因素的干扰，即使面对造血功能抑制引起的血型抗原变化，也能准确定型，保证输血安全、有效[19-22]。从分子水平分析抗原变化并发现不同疾病中出现的新ABO等位基因变异，无疑是输血领域未来的发展趋势，且随着基因分型技术广泛而深入的应用，血型抗原与癌症等疾病的内在联系也势必展现在人们眼前。

参考文献

[1]傅启华，王学峰，向东，等. 临床输血学——理论与实践[M]. 上海: 上海交通大学出版社，2014：219-223.

[2]黄菲，李翠莹，甘新宇，等. 白血病致ABO血型抗原减弱4例[J]. 中国输血杂志， 2011， 24(1): 67-68.

[3]庞辉. 急性白血病致ABO血型变异1例[J]. 临床输血与检验， 2012， 14(2): 183-184.

[4]孙六娜，罗恒，蔡振华. 急性髓性白血病引起ABO血型改变1例报道[J]. 检验医学与临床， 2012， 9(18): 2396-2397.

[5]王兴，杨莉莉，任红，等. 慢性粒细胞白血病致ABO血型鉴定疑难1例[J]. 实用医药杂志， 2014， 31(4): 300.

[6]相丽欣, 陈曦阳, 李忠俊，等. 白血病患者ABO血型抗原病理变异5例[J]. 中国输血杂志， 2011， 24(10): 894-895.

[7]赵俊锋. 1例白血病Rh血型变异患者的输血[J]. 中外医学研究， 2014， 12(6): 164.

[8]韩光辉，鞠海英. 白血病患者ABO血型抗原减弱的鉴定方法[J]. 中国实验诊断学， 2013， 17(8): 1490-1491.

[9]刘静，李志强. 部分恶性血液病患者红细胞A、H抗原表达与基因启动子CpG岛甲基化研究[J]. 临床输血与检验， 2011， 13(3): 205-211.

[10]孟凡科. 恶性血液病ABO抗原减少与ABO基因表达异常的相关性[J]. 中国医药指南， 2013， 11(31): 30-31.

[11]索朗卓嘎， 吴学忠. 白血病患者ABO变异等位基因相关研究[J]. 西藏科技， 2012， 37(6): 53-55.

[12]NOVARETTI MC，DOMINGUES AE，MANHANI R，et al. ABO genotyping in leukemia patients reveals new ABO variant alleles[J]. Genet Mol Res， 2008， 7(1): 87-94.

[13]BIANCO-MIOTTO T，HUSSEY DJ，DAY TK，et al. DNA methylation of the ABO promoter underlies loss of ABO allelic expression in a significant proportion of leukemic patients[J]. PLoS One， 2009， 4(3): e4788.

[14]应燕玲，陶苏丹，和艳敏，等. 一例ABO血型系统B抗原减弱表达的分子机制[J]. 中华医学遗传学杂志， 2011， 28(4): 397-400.

[15]CHIHARA Y，SUGANO K，KOBAYASHI A，et al. Loss of blood group A antigen expression in bladder cancer caused by allelic loss and/or methylation of the ABO gene[J]. Lab Invest， 2005， 85(7): 895-907.

[16]马海芳. ABO血型变异的研究进展[J]. 检验医学与临床， 2011， 8(15): 1877-1880.

[17]TAVASOLIAN F，ABDOLLAHI E，VAKILI M，et al. Relationship between ABO blood group and acute lymphoblastic leukemia[J]. Iran J Ped Hematol Oncol， 2014， 4(1): 1-4.

[18]SANZ C，NOMDEDEU M，BELKAID M，et al. Red blood cell alloimmunization in transfused patients with myelodysplastic syndrome or chronic myelomonocytic leukemia[J]. Transfusion， 2013， 53(4): 710-715.

[19]王超, 李素萍, 李敏, 等. 肿瘤患者疑难血型鉴定和基因分型的相关探讨[J]. 中国实验血液学杂志， 2013， 21(3): 780-784.

[20]黄丹丹. A抗原减弱白血病患者的ABO血型鉴定[J]. 中国输血杂志， 2013， 26(9): 864-866.

[21]DENOMME GA. Prospects for the provision of genotyped blood for transfusion[J]. Br J Haematol， 2013， 163(1): 3-9.

[22]庄光艳, 闫芳, 侯玉涛, 等. 血液病致ABO抗原减弱的血型基因定型研究[J]. 北京医学， 2014， 50(6): 478-480.

(本文编辑：范基农)