参芎化瘀胶囊预处理对全脑缺血再灌注大鼠损伤及平衡能力的影响

黄海玲张卫红邵通①张晓松李建民赵亚宁①吴双范亚霞岳淑玲李海波

(华北理工大学附属医院，①护理与康复学院河北唐山063000)

[摘要]①目的探讨不同时间模式参芎化瘀胶囊预处理对全脑缺血再灌注大鼠损伤及平衡能力的影响。②方法将64只成年SD雄性大鼠随机分为对照组、模型组、参芎化瘀胶囊预处理7d组(药物干预1组)和参芎化瘀胶囊预处理14d组(药物干预2组)，每组16只，并分1、3、7、14d 4个时间点进行测量，分别给予药物干预7、14d预处理。制备全脑缺血再灌注动物模型。HE染色观察海马CA1区组织学改变，平衡木法测定行为学评分。③结果与对照组比较，模型组神经元细胞数量减少明显，所有时间点行为学评分升高(P<0.05)；与模型组比较，参芎化瘀胶囊干预组神经元细胞数量增加，行为学评分降低(P<0.05)；和药物干预1组比较，药物干预2组神经元细胞数量、行为学评分在7、14d时间点差异有统计学意义(P<0.05)。④结论参芎化瘀胶囊预处理对全脑缺血大鼠再灌注神经元损伤具有保护作用，对肢体协调、平衡、肌力恢复有促进作用，药物的作用效果和预处理时间的长短有关系。

[关键词]缺血再灌注损伤参芎化瘀胶囊预处理平衡能力

[中图分类号]R 36[文献标识码]B

【基金项目】河北省卫生厅课题(编号：20110527);河北省教育厅重点课题(编号：ZD2010106)

【作者简介】黄海玲(1978-)，女，医学硕士。研究方向：护理管理与教育，脑卒中。

Effect of shenxiong huayu capsule in different time patterns of preconditioning on cell pathology and balance ability on cerebral ischemia reperfusion injury in ratsHUANGHailing,ZHANGWeihong,SHAOTong,etal(AffiliatedHospitalofNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

ABSTRACT[]ObjectiveTo explore different temporal patterns of shenxiong huayu capsule pre treatment effect on cerebral ischemia reperfusion rat damage and balance ability.Methods64 adult male SD rats were randomly divided into for control group,model group and shenxiong huayu capsule pre treatment 7d group(intervention group) and shenxiong huayu capsule pre treatment for 14d group (drug intervention group 2),1,3,7,14d four time points,and each group with16 rats,drug intervention groups were given Shenxiong Huayu capsule group 7 and 14 days after pre processing.Animal model of cerebral ischemia reperfusion injury.HE staining was observed in the hippocampus CA1 area,and the behavior score was determined by the method of balance beam test.ResultsCompared to the control group,the number of neuronal cells significantly reduced in the model group,all the time that the act science scores were significantly increased (P<0.05);and comparede with model group,the number of neurons in Shenxiong Huayu capsule group intervention increased,behavioral scores were significantly lower (P<0.05);and other groups compared to drug intervention two groups of neurons quantity,behavior scores in 7d,14d time points were the most significantly (P<0.05).ConclusionShenxiong huayu capsule pre treatment on cerebral ischemia in rats and then reperfusion neuron injury had a protective effect,on the recovery of limb coordination,balance,muscle strength,and how about the strong were related to the length of drugs pretreatment time.

[KEYWORDS]Reperfusion injury.Shenxiong huayu capsule.Pretreatment.Balance ability

脑缺血再灌注损伤后，各种炎症因子、钙离子超载、氧自由基损害、能量缺乏等引发了细胞死亡、轴突断裂、联系中断、行为功能障碍等一系列病理生理变化，高病死率、致残率促进了研究人员不断探索其有效的预防机制。1994年，Fisher等[1]提出了预防性脑保护的概念，侧重于预防性使用某些药物或措施后降低急性缺血性脑血管病的发生率和脑损伤程度。

参芎化瘀胶囊对局部脑损伤有保护作用，但不同时间模式预处理对于全脑缺血再灌注损伤大鼠急性期神经元细胞数量和肢体平衡能力的影响是否有差异至今未见报道。本实验通过构建全脑缺血再灌注损伤模型，观察海马区神经元细胞形态、大鼠平衡能力的变化，探讨不同时间模式参芎化瘀胶囊预处理对全脑缺血再灌注大鼠损伤及平衡能力的影响。

1材料与方法

1.1动物雄性健康 SD大鼠64只，体质量250～320g(北京维通利华实验动物技术有限公司，SCXK京2010-0013)；喂养于华北理工大学动物实验室，室温20℃～23℃，自然光照，自由进食。

1.2药物参芎化瘀胶囊是华北理工大学附属医院药剂科自制的中药制剂(冀药制字Z20051586)，主要由人参(3.5%)、土鳖虫(5.25%)、川芎(7.5%)、乳香(制1.5%)、没药(制1.5%)、全蝎(3%)、紫河车(3%)、龙血竭(3%)、五味子(5%)、石菖蒲(5%)、郁金(4.2%)、桑葚子(3.5%)等配制而成，规格0.4 g 1粒。

1.3用法实验时将参芎化瘀胶囊溶于双蒸水，浓度48g/L，参芎化瘀胶囊+脑缺血组按体质量给药，剂量为480mg/kg，灌胃给药(每次给药前称体质量)，为了观察不同时间模式预处理对于全脑缺血再灌注模型的影响，药物干预1组造模前7 d开始给药，药物干预2组造模前14 d开始给药，对照组和模型组给予双蒸水灌胃至相应时间的术日晨。

1.4试剂与仪器

1.4.1试剂。HE试剂(本校基础实验室提供)。

1.4.2仪器。Motic 6.0图像采集及图像分析系统(麦克奥迪医学图像分析系统)；JGD-50高频电刀(张家港市航天医疗电器有限公司)，图像采集及图像分析系统(美国Bio-Rad公司)。

1.5方法

1.5.1模型制作。对照组不作处理，模型组和用药组采用改良的Pulsinelli四血管闭塞法制作大鼠全脑缺血模型 (电凝双侧椎动脉，分离双侧颈总动脉，24h后夹闭双侧颈总动脉15min后再通)。造模成功标准：夹闭颈总后30～60s内大鼠昏迷，翻正反射消失，瞳孔放大，眼睛颜色由红变白，呼吸急促，松开动脉夹后20～30s，眼睛颜色快速恢复红色，大鼠意识转清并能活动。剔除夹闭后诱发癫痫者、术中颈总破裂大出血者、术后出现肢体瘫痪者、术后意识障碍者。脑缺血15min再灌注1、3、7、14d分别观察平衡木行为学改变及神经细胞形态改变情况。

1.5.2动物分组。64只成年SD雄性大鼠分对照组、模型组(等量生理盐水灌胃)和参芎化瘀胶囊组(1组和2组均采用参芎化瘀胶囊48mg/kg灌胃，分别从造模前7、14d开始，用药至处死当天)，每组各16只，每时间点4只。手术不成功者和死亡者予以补齐。

1.6观察指标与检测方法

1.6.1HE染色。脑组织灌注后固定于4%多聚甲醛溶液中24h，常规脱水、浸蜡、包埋。石蜡切片机自视交叉后约2mm处向后做冠状面连续切片，厚度约4um。按常规染色，200倍镜下随机观察脑组织海马CA1区不重叠的6个视野，采用Motic 6.0数码医学图象分析系统测量海马CA1区存活神经元个数，取其平均值进行统计分析。

1.6.2行为学测试。所有大鼠均于术后1、3、7、14d的同一时间点做行为学评分。平衡木评分标准如下：姿态稳定0分，抓住边缘1分，抱住木棍一侧肢体掉下2分，抱住木棍一侧两侧肢体掉下或转动>60s 3分，试图平衡但掉下或转动>40s 4分，试图平衡但掉下或转动>20s 5分，掉下、不想在平衡木上呆或吊在平衡木上6分。

2结果

2.1HE染色对照组大鼠海马CA1区神经元细胞排列整齐、紧密，结构清晰，染色均匀，核大而圆，细胞间分界清楚，和对照组相比，模型组大量神经元进行性坏死：1d出现大量红色神经元，核染色质深染，部分神经元出现水肿，3d水肿加重，排列松散，细胞轮廓不清，细胞核模糊，7d核皱缩明显，部分细胞溶解碎裂，14d大量坏死神经元溶解，余红色残碎部分，仅少数细胞形态可辨，细胞分布松散不均，神经元数量明显减少(P<0.05)。参芎化瘀胶囊干预各组神经元病变均较模型组减轻，1d可见许多红色神经元，但较模型组明显减少，正常神经元数目增多(P<0.05)，7、14d存活细胞数量较模型组多，排列较模型组规整，其中以2组存活神经元数量最多，比较1组P<0.05。见图1，表1。

2.2行为学所有时间点，对照组得分最低，模型组得分最高，药物干预组得分低于对照组和模型组，药物干预2组相对于药物干预1组7、14d差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

注：a对照组；b模型组；c药物干预1组；d药物干预2组 图1　各组HE染色比较，7d，200倍

表1　各组海马CA1区存活神经元数量的比较

注：和对照组比较,*P<0.05；和模型组比较,△P<0.05；和药物干预1组比较,◆P<0.05

表2　各组行为学评分结果的比较

注：和对照组比较，*P<0.05；和模型组比较，△P<0.05；和药物干预1组比较，◆P<0.05

3讨论

缺血性脑损伤涉及复杂的病理生理机制，包括血脑屏障破坏、炎症反应、神经元凋亡等。其中，神经元的凋亡是急性脑损伤过程中最重要的病理机制之一，细胞凋亡加重脑损伤，反之，抑制细胞凋亡则可以减轻脑损伤。预处理通过调控细胞间粘附分子、脑红蛋白等多种基因的表达、减轻神经细胞水肿、抑制炎症反应、增加脑缺血耐受，产生脑保护作用[2～4]。

参芎化瘀胶囊含有川芎7.5%，功效行气活血；石菖蒲5%，涤痰开窍；全蝎3%，和川芎合用通络活血；人参3.5%，功效活血通络、益气养血、定痛疗伤等；此外桑葚、郁金香、乳香、土鳖虫、紫河车、黄芪、没药、三七等多味中草药辅助增加活血益气、调节免疫之功效。本实验中，参芎化瘀胶囊组大鼠椎体神经元病变较模型组均减轻，CA1区存活神经元数量最多，这说明参芎化瘀胶囊预处理对全脑缺血再灌注损伤有脑保护作用，能减少神经元的死亡，和牛静[5]等的研究结果相似；大鼠平衡木行为学评分结果显示，在相同的实验环境下，药物干预组得分低于模型组，这说明模型组抗脑损伤的能力较药物干预组低下，参芎化瘀胶囊预处理可以有效减轻脑损伤，促进运动整合协调功能重塑和肌力的恢复。药物干预2组疗效优于1组，说明有效微环境的准备和时间变量之间存在相关性。

脑缺血耐受的观察主要从细胞形态和功能两方面进行。全脑缺血主要观察海马区锥体神经元细胞，一般通过计数相应区域神经元存活数量来评价预处理的脑保护作用。近年研究显示，银杏叶预处理7d能有效调控缺血脑损伤后Bcl-2和Bax的基因表达，减轻对神经元细胞的损害[4]。黄芩、人参皂甙Rd预处理能改善永久性脑缺血大鼠智能缺陷和细胞形态，减少细胞凋亡[6]，这和笔者的实验结果相近。对预处理机制的研究认为，缺血预处理对机体本身是伤害性的应激过程，在临床难以推广，而药物预处理通过激发或者模拟机体内源性的保护物质发挥作用，对机体损伤小，具有潜在的临床应用价值。

笔者认为，参芎化瘀胶囊的多种有效成分协同，提高了细胞抵抗缺血缺氧的能力，增加了细胞存活数量；同时，效果的好坏和预处理的时间长短有关系。

参考文献

[1]Fisher M, Jonas S, Sauo RL, et al. Prophylactic neuroprotection for cerebral ischemia[J]. Stroke, 1994, 25(6):1075-1080

[2]Pera J,Zawadzka M,Kaminska B,et al.Neurotrophic factor expression after focal brain ischemia preceded by different preconditioning strategies[J].Cerebrovase Dis,2005,19(4) :247-252

[3]朱克军, 黄洪, 储辉, 等. 缺血预处理对大鼠创伤性脑损伤后脑组织细胞间粘附因子-1表达的影响[J]. 中华脑创伤杂志, 2014, 30(5):464-466

[4]张继龙, 翁方中, 陈国华, 等. 银杏叶对缺血脑损伤后Bcl-2和Bax的基因表达的影响[J]. 中国中西医结合急救杂志, 2007,14(1):56-79

[5]牛静, 李建民, 赵雅宁, 等. 参芎化瘀胶囊对脑缺血再灌注损伤大鼠推荐使用剂量的研究及其对VEGF表达的影响[J]. 中国实验方剂学杂志, 2013,19(2):234-238

[6]王瑞婷. 黄芩茎叶总黄酮对Aβ致大鼠学习记忆损伤的影响及机制研究[D].石家庄：河北医科大学,2010

(王一伊编辑)