新疆维吾尔族与汉族Graves病患者血清IL-17水平及其基因多态性研究

黄玫1,2， 王岩2， 樊勇1

(1新疆医科大学第一附属医院内分泌科, 乌鲁木齐830054;2新疆昌吉州人民医院内分泌科,新疆昌吉831100)

摘要：目的探讨维吾尔族(简称维族)与汉族Graves病(GD)患者血清白细胞介素17(IL-17)与IL-17rs763780基因多态性的差异及其与CD之间的关系。方法选择初发、未经治疗的GD患者193例(GD组，维族99例，汉族94例)及健康体检者188例(健康对照组，维族97例，汉族91例)，应用酶联免疫吸附法检测血清IL-17水平。用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析方法(PCR-RFLP)测定IL-17rs763780基因多态性。结果与健康对照组比较，GD组血清IL-17水平明显升高，差异有统计学意义；维族GD患者血清IL-17水平较汉族GD患者明显升高，差异有统计学意义。GD组血清IL-17水平与TRAb、FT3、FT4呈正相关(r=0.139， P<0.05；r=0.159， P<0.05；r=0.047， P<0.01)。与健康对照组比较，GD组IL-17rs763780等位基因T分布高于等位基因C，差异有统计学意义。与健康对照组比较，GD患者IL-17rs763780位点TT分布高于TC、CC基因型，差异有统计学意义(P<0.05)。与汉族GD组比较，维族GD患者IL-17rs763780等位基因C和T分布比较差异无统计学意义；维族GD患者与汉族GD患者IL-17rs763780位点 CC、TC、TT基因型分布比较差异无统计学意义(P>0.05)。GD组3种不同基因型(CC、TC、TT)血清IL-17水平有差异。结论IL-17在GD中的高表达提示其与可能与GD的发病相关；IL-17rs763780基因多态性可能与IL-17水平有关。

关键词：Graves病； 白细胞介素17； 单核苷酸多态性； 汉族； 维吾尔族

中图分类号：R581文献标识码：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.04.011

[收稿日期：2014-08-06]

Study of IL-17 gene polymorphism with Graves patients on

Uyghur and Han in Xinjiang

HUANG Mei1， WANG Yan2， FAN Yong1

(1DepartmentofEndocrinology,TheFirstAffiliatedHospital,XinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830054,China;2DepartmentofEndocrinology,ThePeople′sHospitalofChangji

HuiAutonomousPrefecture,Changji831100,China)

Abstract：ObjectiveTo explore the differences of serum interleukin-17 (IL-17) and IL-17 rs763780 gene polymorphism between Uyghur and Han GD patients, and the relationship with Graves disease (GD). MethodsChoose the incipient, 193 patients was untreated GD (GD group, 99 of Uyghur and Han, 94 cases) and 188 cases of healthy physical examination(healthy control group, 97 cases Uyghur and han, 91 cases), using enzyme-linked immunosorbent method to detect the serum level of IL-17. Using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis method (PCR-RFLP) determination of IL-17 rs763780 gene polymorphism. ResultsGD group compared with control group, the serum IL-17 level increased significantly, the difference was statistically significant, Uyghur compared with Han patients with GD, GD patients serum levels of IL-17 Uyghur patients increased significantly , the difference was statistically significant. In the hyperthyroidism group, the serum level of IL-17 and TRAb, FT3, FT4 were positively correlated (r=0.139， P<0.05；r=0.159， P<0.05；r=0.047， P<0.01). Compared with healthy controls, patients with GD group of IL-17 rs763780 allele T distribution is higher than the distribution of allele C, the difference was statistically significant. Compared with healthy controls, patients with GD IL-17 rs763780 loci TT genotype distribution above TC, CC genotype, the difference was statistically significant (P<0.05). To compared with the Han GD group, there was no statistically significant difference in Uyghur GD group of IL-17 rs763780 allele C and T distribution; Uyghur GD patients compared with Han GD patients , there was no statistically significant difference in genotype distribution of IL-17 rs763780 loci CC, TC, TT (P>0.05). GD group 3 different genotypes (CC, TC, TT) between the serum level of IL-17. ConclusionHigh expression of IL-17 in GD prompt its and may be associated with the onset of GD; IL-17 rs763780 gene polymorphism may be related to the level of IL-17.

Key words: hyperthyroidism； interleukin 17； single nucleotide polymorphisms； the Han nationality； the Uyghur

甲状腺功能亢进症(简称甲亢)是甲状腺腺体本身产生甲状腺激素过多而引起的甲状腺的毒症。其中以Graves病(GD)最为常见，占所有甲亢的85%左右，其发病机制复杂, 是一种涉及细胞和体液免疫紊乱的自身免疫性疾病。该病患者甲状腺功能明显异常，血清甲状腺激素水平明显升高，促甲状腺激素水平降低。近年来国内外有研究显示白细胞介素17 (IL-17)与Graves病的发病有一定相关性[1-2]。有研究报道IL-17与中国汉族人群Graves病发病有关[3-4]，但缺乏少数民族与IL-17及其基因多态性的相关研究。本研究主要探讨汉族与维吾尔族(维族)GD患者IL-17水平的差异与IL-17rs763780基因多态性及其与GD的相关性。

1资料与方法

1.1临床资料选择2013年9月-2014年3月在新疆医科大学第一附属医院内分泌科门诊就诊的新确诊未经任何治疗的GD患者193例(GD组)，维族99例，汉族94例，男性43例，女性150例，年龄13～72岁，平均(36.6±12.5)岁。患者收入诊断标准依据中华医学会内分泌学分会制定的《甲状腺机能亢进症临床诊断标准》和《Graves病的诊断标准》。排除合并其他自身免疫性疾病、急性感染、慢性阻塞性肺疾病、肿瘤及既往有甲状腺疾病史患者。另从健康体检中心随机选取选取188例(维族97例，汉族91例)健康体检者(排除既往有甲状腺疾病史及有甲状腺相关疾病家族史者)作为健康对照组，其中男性40例，女性148例，年龄16～72岁，平均(37.9±12.4)岁。两组性别及年龄比较差异无统计学意义。所有标本甲状腺功能采用罗氏试剂盒测试。本研究通过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会审查(审批号为20131011-05)，受试对象均已签署知情同意书。GD组甲功均异常，三碘甲状腺原氨酸(FT3)、血清游离甲状腺素(FT4)、促甲状腺激素受体抗体(TRAb)均升高，超敏促甲状腺激素(s-TSH)降低；健康对照组甲功正常。受试对象甲状腺功能资料见表1。

表1　受试对象甲状腺功能资料( ±s)

1.2方法

1.2.1测定血清IL-17水平用BD促凝管取外周血3 mL，3 000 r/min离心5 min，取血清置于-20℃保存，1个月内测定。应用酶联试剂盒(湖北伊莱瑞特生物科技有限公司)、酶标仪(PHOMO型，郑州安图)测定血清IL-17水平。

1.2.2基因多态性检测取外周静脉EDTA抗凝血600 μL，应用血液基因组DNA提取试剂盒提取DNA(TIANGEN，中国北京，按说明书操作)，置于-20℃保存。根据文献[5]设计细胞因子IL-17rs763780引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。上游引物：5′GGAATGCAAACAAACACCTG3′；下游引物：5′GTTCCCATCCAGCAAGAGAC3′。用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)进行基因型分型。首先进行PCR扩增：(1)扩增体系：反应总体积为20 μL，模板DNA 2 μL，上下游引物各0.5 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。(2)反应条件：95℃预变性3 min，然后以94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s共进行35个循环，72℃延伸5 min，4℃退火。(3)电泳：取5 μL PCR产物在溴化己啶染色1%琼脂糖凝胶中电泳25 min，目的片段为407 bp，扩增成功。其次对目的片段进行限制性酶切：(1)酶切反应体系：反应总体积为30 μL ，其中包括PCR纯化产物5 μL，内切酶FastDigest NIaⅢ 0.5 μL 10×Buffer 2 μL，去离子水22.5 μL。(2)酶切反应条件：37℃水浴5 min。最后进行基因分型：取10 μL酶切产物在溴化己啶染色1.2%琼脂糖凝胶中电泳25 min，观察并记录结果。抽样PCR扩增产物送上海生工生物工程股份有限公司进行基因测序，进一步验证目的片段。

2结果

2.1IL-17水平比较

2.1.1GD组与健康对照组血清IL-17水平的比较GD组血清IL-17水平为(441.98±139.37) pg/mL，较健康对照组的(181.69±49.79) pg/mL明显升高，差异有统计学意义(t′=24.87，P<0.05)。

2.1.2GD组内汉族与维族患者血清IL-17水平的比较维族GD患者血清IL-17水平为(473.35±125.48) pg/mL，较汉族患者(410.60±145.99) pg/mL明显增高，差异有统计学意义(t=3.26，P=0.001)。

2.2相关性分析在GD患者中，IL-17水平与TRAb、FT3、FT4呈正相关(r=0.139， P<0.05；r=0.159， P<0.05；r=0.047， P<0.01)。

2.3基因分型经PCR扩增后可获得407 bp大小的目的片段，限制性内切酶NIaⅢ能特异识别CATG序列，当IL-17rs763780位点T基因突变为C时，则产生酶切位点，37℃水浴5 min后消化生成290 bp和117 bp 2个片段。经琼脂糖凝胶电泳后能分别观察到407、290、117 bp 3种条带(图1)。抽样PCR扩增产物进行基因测序(图2)。

1、8为纯合子TT型，5、7为纯合子CC型，2、3、4、6为杂合子TC型

图1IL-17rs763780基因多态性PCR产物酶切电泳图

图2　IL-17rs763780基因多态性测序结果

2.3.1IL-17rs763780等位基因及基因型分布与健康对照组相比，IL-17rs763780等位基因T分布高于等位基因C，差异有统计学意义。与健康对照相比，GD组患者IL-17rs763780位点TT基因型分布高于TC、CC基因型，差异有统计学意义(P<0.05)。维族GD患者与汉族GD患者IL-17rs763780等位基因C和T分布比较差异无统计学意义；与汉族患者相比，维族患者IL-17rs763780位点 CC、TC、TT基因型分布比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.3.2不同基因型之间血清IL-17水平的比较GD患者CC、TC、TT型3种基因型之间血清IL-17水平比较差异有统计学意义(F=5.136，P=0.007)；TC、TT、CC型3种基因型两两比较，TC型IL-17水平高于CC型，TT型IL-17水平高于CC型，差异有统计学意义(P=0.009， P=0.002)；TC型与TT型比较，差异无统计学意义(P=0.352)。

3讨论

GD的病因较为复杂，是各种不同环境、基因、内源性和局部因素等多因素相互作用的结果。目前遗传背景被认为是GD发病过程中的重要因素。流行病学调查证实，GD发病有着明显的遗传倾向[6]。丹麦一项对8 699对双胞胎的调查研究表明，在单卵双胞胎中，2人均患GD的概率为35%，而在双卵双胎中，2人共患GD的概率仅为3%[7]。根据遗传模型的统计结果，得出如下结论：在GD的各种致病因素中，遗传因素占79%，环境和激素等其他因素占21%。GD并不遵守孟德尔遗传定律，是许多微效基因和外界环境因素相互作用的复杂结果，是一种涉及多个基因遗传的复杂疾病，单个基因的突变对其没有明显的作用，多个基因单核苷酸多态性(SNPs)的联合作用才有可能导致其易感性的改变。

表2　GD组与健康对照组、维族GD与汉族GD患者IL-17rs763780等位基因分布与基因型分布/例(%)

近年来研究发现，Th17细胞是一类新的CD4+T辅助细胞，在防御胞外细菌感染、介导慢性炎性反应以及自身免疫性疾病中发挥了重要作用[8]。IL-17是Th17细胞分泌的特征性细胞因子。IL-17在1995年被发现时，被认为是不重要的，因其对B细胞和T细胞的功能缺乏直接的影响。而现在因其在诱导炎症方面的强大功能而越来越受到重视[9]。许多研究表明，Th17细胞在自身免疫性疾病中发挥重要的调节作用，在许多自身免疫疾病及相应动物模型的血清及组织中均能检测到IL-17的高表达[10]。国内已有研究显示，IL-17水平在自身免疫性甲状腺疾病中明显升高[11]。本研究探讨IL-17及其基因多态性与GD的关系，旨在为GD的治疗提供新的治疗策略。

本研究发现， GD组血清IL-17水平显著高于健康对照组，与已有研究结论相符[12-13]，表明IL-17高水平表达在GD的发生中具有重要作用。本研究首次发现维吾尔族、汉族GD患者的IL-17水平存在差异，提示GD的发病可能与民族有关。在GD组和健康对照组中，均存在CC、TC、TT 3种基因型，与健康对照组比较，GD组3种基因型及等位基因频率分布差异均有统计学意义(P<0.05)，提示IL-17rs763780基因多态性可能与GD的发病相关。维族与汉族GD患者IL-17rs763780基因多态性在等位基因频率及基因型分布上尚未发现明显差异。本研究进一步验证了血清IL-17水平与甲亢患者FT3、FT4呈正相关，并发现GD患者TRAb与IL-17水平也呈正相关，此结果与陈紫君等[1]的研究结论IL-17与TRAb无相关性不同。同时，本研究发现，GD组3种不同基因型之间血清IL-17水平有差异； TC与TT基因型血清IL-17水平均明显高于CC基因型患者(P<0.01)，TC与TT基因型血清IL-17水平差异无统计学意义(P>0.05)，提示在GD中，可能主要是TC和TT基因型促使IL-17高表达，成为GD发病的一个危险因素。

分析基因多态性与GD遗传易感性之间的关系对从遗传学角度探讨基因多态性与GD的关系和深入认识其发病机制将有重要意义。本研究结果表明，IL-17可能与汉族、维族GD发病有关，IL-17rs763780基因多态性可能与GD发病具有相关性，尤其是TC和TT基因型可能是促使GD发病的危险基因类型。此多态位点在2个民族间的等位基因频率及基因型分布尚未发现明显差异，可能与样本量小、民族分布的地域性有关。新疆是一个多民族聚居的区域，幅员辽阔，民族分布也存在南北疆差异，新疆医科大学第一附属医院是疆内一流的综合性三甲医院之一，病员覆盖全疆，但对本研究来说，受试对象中北疆患者偏多。国内目前已有多个关于汉族GD与IL-17单核苷酸多态性的相关研究，但缺乏有关少数民族的研究，关于IL-17单核苷酸多态性与维吾尔族GD患者的确切关系尚需多中心、大样本、多位点研究。

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(本文编辑杨晨晨)