2种HPV检测方法在宫颈病变诊断中的应用研究

张媛媛1， 路玲2， 古扎丽努尔·阿不力孜1， 李华1， 朱明玥1

(1新疆医科大学附属肿瘤医院妇外五科， 乌鲁木齐830011；2新疆乌鲁木齐市妇幼保健医院， 乌鲁木齐830001)

摘要：目的比较第2代杂交捕获技术(HC-2)和低温PCR检测法对宫颈病变的诊断应用价值。方法收集2013年4月-2014年4月来新疆医科大学附属肿瘤医院就诊的232例维吾尔族宫颈癌、宫颈上皮内瘤样病变(CIN)及慢性宫颈炎患者宫颈分泌物标本，分别进行HC-2和低温PCR检测，低温PCR技术检测不同宫颈病变组织中HPV亚型，HC-2法测定病变组织中HPV DNA含量。分析2种方法检测结果的一致性。结果在232例标本中，低温PCR检测HPV阳性76例，阳性率为32.76%；HC-2检测HPV阳性70例，阳性率为30.17%。2种方法检测结果一致者210例，一致率为90.51%，Kappa值为0.780；慢性宫颈炎患者HPV亚型以HPV16、HPV56为主；CINⅠ患者HPV亚型以HPV16、HPV18、HPV59为主；CINⅡ患者HPV亚型以HPV16、HPV59为主；CINⅢ患者HPV亚型以HPV16、HPV31为主；宫颈癌患者HPV亚型以HPV16、HPV18、HPV58为主；CINⅠ～Ⅲ以及宫颈癌患者的HPV DNA 含量均高于慢性宫颈炎患者(P<0.01)，宫颈癌患者的HPV DNA含量高于CINⅠ～Ⅲ，差异均有统计学意义(P<0.01)。结论HC-2和低温PCR检测在宫颈严重病变中有较强的一致性，2种检测方法对宫颈病变的筛查均有较好的应用价值。

关键词：人类乳头状瘤病毒； 宫颈癌； 宫颈上皮内瘤样病变； 聚合酶链反应

中图分类号：R737.33文献标识码：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.04.005

[收稿日期：2014-11-23]

基金项目：国家自然科学基金(81272335)； 新疆医科大学科研创新基金(XJC201375)

作者简介：张媛媛(1981-)，女，主治医师，研究方向：妇科肿瘤。

The applied research of two types of HPV detection methods in the

diagnosis of cervical lesions

ZHANG Yuanyuan1, LU Ling2, Guzalnur Abliz1, LI Hua1, ZHU Mingyue1

(1DepartmentofGynecologyV,AffiliatedTumorHospital,XinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830011,China;2UrumqiCityMaternalandChildHealthHospital,Urumqi830001,China)

Absract： ObjectiveTo compare the diagnostic and applied value of hybrid capture 2 technology (HC-2) and low temperature PCR assay in cervical lesion. MethodsSpecimens of cervical secretions from 232 cases of cervical cancer, cervical intraepithelial neoplasia lesions (CIN) and chronic cervicitis were collected in our hospital. The specimens were detected by HC-2 and low temperature PCR assay and the consistency of the results of two methods was analyzed. ResultsThe HPV positive rate of low temperature PCR detection was 32.76% (76/232) and HPV positive rate of HC-2 was 30.17% (70/232) in specimens of 232 cases. The consistent rate of two methods was 90.51% (210/232) and the Kappa value was 0.780; The main HPV subtypes of chronic cervicitis were HPV16, HPV56, and the main HPV subtypes of CINⅠwere HPV16, HPV18, HPV59, and the main HPV subtypes of CINⅡ were HPV16, HPV59, and the main HPV subtypes of CINⅢ were HPV16, HPV31, while the main HPV subtypes of cervical cancer were HPV16, HPV18, HPV58; The HPV DNA levels of CINⅠ-Ⅲ and cervical cancer were higher than chronic cervicitis (P<0.01), in addition, The HPV DNA levels of cervical cancer were higher than CINⅠ-Ⅲ (P<0.01). ConclusionThe consistency of HC-2 and low temperature PCR detection in cervical severe lesions was strong and the two kinds of detection methods both had strong application value for the screening of cervical lesions.

Key words: human papillomavirus; cervical lesion; PCR assay; hybrid capture 2

宫颈癌是目前唯一的可望被消灭的癌症，因为已确定其主要和必要的病因就是人类乳头状瘤病毒(HPV)感染[1]。HPV是小分子双链DNA病毒，其基因型达200多型,根据HPV与宫颈癌的相关性分为高危型和低危型,高危型HPV的持续感染是宫颈癌和癌前病变发生和发展的必要条件。全世界每年有46.6万宫颈癌患者，其中80%的宫颈癌患者在发展中国家，中国约占1/3[2]。新疆宫颈癌的发病率又高于全国平均水平，死亡率居全国首位，在维吾尔族宫颈癌中HPV阳性率在80%以上，其中HPV16的构成比高达90.0%以上[3]。本研究通过对HPV 2种检测方法(HC-2 、低温PCR)的比较，探究2种检测方法在筛查维吾尔族宫颈癌、宫颈癌癌前期病变(CIN)及慢性宫颈炎中HPV的应用价值，为完善宫颈癌筛查方法提供依据。

1资料与方法

1.1研究对象选择2013年4月-2014年4月来新疆医科大学附属肿瘤医院就诊的维吾尔族宫颈癌、CIN及慢性宫颈炎患者232例，年龄18～69岁，平均年龄(52.63±8.14)岁。所有病例均未接受放化疗，未服激素类药物，且宫颈癌患者均为南疆地区长期居住的妇女。

1.2方法

1.2.1标本采集HC-2标本的采集采用液基法，由妇科医师采用配套的宫颈采样器在宫颈口沿同一方向旋转3～5圈，贮存于Digene专用采样瓶中，用于HC-2检测。低温PCR标本采用女性专用宫颈刷擦拭宫颈处，采集宫颈分泌物，置入95%酒精中，沿折痕处将宫颈刷折断放入管中，-20℃保存送检。

1.2.2HC-2检测法HC-2法测定病变组织中HPV DNA含量。操作严格按照试剂盒(美国Digene 公司)说明书进行，主要步骤有DNA提取、杂交、捕获、信号放大及信号检测。阳性结果的判断：检测样本的相对光单位(RlU)与标准阳性对照的RLU 比值>110。

1.2.3低温PCR检测法低温PCR技术检测不同宫颈病变组织中HPV亚型。参照中国科学院院士洪国藩院士创建的低温PCR分析技术。主要步骤：(1)DNA提取：取1 mL样品，离心5 min；用1 mL三蒸水洗涤沉淀，用1 mL的Buffer溶液洗涤；再次离心5 min；加入100 μL含0.1 mg/mL蛋白酶的Lysis buffer，45℃～55℃保温过夜；95℃，消化10 min；离心5 min；留取上清，作为PCR检测的模板。(2) PCR实验：第1次PCR过程，低温反应体系 20 μL，引物Β11 μL，引物Β21 μL，患者标本DNA 1 μL， 水2 μL，总计25 μL；Β1：5′-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3′，Β2：5′-CAACTTCATCCACGTTCACC-3′。第2次PCR过程，低温反应体系20 μL，引物GP5 1 μL，引物MY09 1 μL，第1次PCR产物 1 μL，水2 μL，总计25 μL。以上2次PCR过程变性温度85℃反应2 min，85℃反应30 s，40℃反应30 s，60℃～65℃反应1 min，共30个周期，最后延伸温度65℃反应10 min。(3)琼脂糖胶电泳：取5 μL第2次PCR产物与Loading buffer混合，2%的Agarose检测，阳性产物用于测序。(4) DNA测序，三蒸水13.5 μL，5倍反应缓冲液3.5 μL，BigDye1.1 1 μL，测序引物 1 μL，第2次PCR产物 1 μL，在PCR测序仪上进行测序反应。(5)BLAST：根据样品测序所得DNA序列截取约50个序列较好的碱基在NCBI 网站上Blast，找到完全匹配的HPV类型。

1.2.4阴道镜及病理学检查使用碘染色的方法在阴道镜下协助下采集宫颈病变组织，用4%多聚甲醛进行标本固定，石蜡包埋后切片，厚度为3 μm。由至少2位病理科的副主任以上医师在镜下进行病理诊断，结果为慢性宫颈炎、CIN、宫颈癌。

2结果

2.1低温PCR与HC-2在不同病变组织中一致性结果在232例标本中，慢性宫颈炎44例，CINⅠ50例，CINⅡ66例，CINⅢ34例，宫颈癌38例。低温PCR检测HPV阳性76例，阳性率为32.76%；HC-2检测HPV阳性70例，阳性率为30.17%。2种方法检测结果一致者210例，一致率为90.51%，Kappa值为0.780。对不同组织一致性检验发现，在宫颈癌中，2种方法的一致性最高，Kappa值为0.894，其次在CINⅡ和CINⅢ一致性较好，而在慢性宫颈炎和CINⅠ中2种方法的一致性一般，见表1。

表1　低温PCR与HC-2在不同病变组织中一致性结果/例

2.2低温PCR检测不同病变组织中HPV亚型分布慢性宫颈炎患者HPV亚型以HPV16(42.86%)、HPV56(28.57%)为主；CINⅠ患者HPV亚型以HPV16(40.00%)、HPV18(20.00%)、HPV59(20.00%)为主；CINⅡ患者HPV亚型以HPV16(43.75%)、HPV59(25.00%)为主；CINⅢ患者HPV亚型以HPV16(58.82%)、HPV31(17.65%)为主；宫颈癌患者HPV亚型以HPV16(58.82%)、HPV18 (15.00%)、HPV58(10.00%)为主，见表2。

2.3HC2检测不同病变组织中HPV DNA含量的比较CINⅠ～Ⅲ以及宫颈癌患者的HPV DNA 含量均高于慢性宫颈炎患者，差异均有统计学意义(P<0.01)；宫颈癌患者的HPV DNA含量高于CINⅠ～Ⅲ，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表3。

表2　低温PCR检测不同病变组织中HPV亚型分布

表3　HC2检测不同病变组织中HPV DNA 含量的比较( ±s)

注：与慢性宫颈炎比较，aP<0.01； 与CINⅠ比较，bP<0.01； 与CINⅡ比较，cP<0.01； 与CINⅢ比较，dP<0.01。

3讨论

新近的研究结果均证实HPV感染是宫颈癌的主要危险因素，而且HPV病毒的型别与载量与宫颈癌的发生相关，尤其是高危型HPV感染患者的风险较大[4]。作为目前唯一获得美国FDA 认证和推荐使用的高危型HPV检测技术——HC-2法在宫颈癌早期筛查中的作用已得到大量研究证实[5]。HC-2是基于核酸杂交的荧光信号放大技术，具有较高的灵敏度、特异性和重复性。但该检测方法只能进行高危型和低危型的分类，不能进行基因型的分类，且在实验中还存在高危型探针可与低危型探针发生交叉反应，除可与自身检测的HPV类型外，还能够与其他类型的HPV发生交叉反应[6]，并且其成本较高，操作复杂，耗时长。

低温PCR检测HPV亚型技术是中国科学院院士洪国藩院士于2007年创建的低温PCR分析体系，该体系开发成为高灵敏度、高精确度的医学检测技术，并成功地用于妇女子宫颈致癌病毒及其他人类病菌的检测[7]。低温PCR(聚合酶链反应)是被合适的抗热DNA聚合酶催化，其独特点在于化学反应变性温度为85℃，取代了传统的94℃～96℃，研究已发现这样可以获得更准确、精准的目标DNA的放大扩增，甚至超过120个PCR热循环，此外这样精准的放大是传统的PCR无法做到的[8]。该体系还有一个很大的优点是PCR样品不必纯化，这样就避免了样品纯化过程中目的DNA的丢失，且在较低的PCR反应温度条件下，使用兼并引物，可以较大可能地扩增出各种HPV，减少了漏诊的可能.

本研究采用2种方法检测HPV感染，结果显示，随着病变的加重，HPV感染率呈上升趋势，且2种方法的Kappa值也随之增大，表明2种检测方法检测的一致性与宫颈病变的严重程度相关，也再次证明HPV感染与宫颈病变密切关联，与前期姚军等[9]的研究结论是一致的。本研究首次采用低温PCR检测了不同病变组织HPV亚型，发现HPV亚型以HPV16、HPV56为主；CINⅠ患者HPV亚型以HPV16、HPV18、HPV59为主；CINⅡ患者HPV亚型以HPV16、HPV59为主；CINⅢ患者HPV亚型以HPV16、HPV31为主；宫颈癌患者HPV亚型以HPV16、HPV18、HPV58为主，体现了维吾尔族与其他地区人群存在差异，也体现了不同的HPV亚型的致病性不同，随着宫颈病变的加重，高危型HPV的感染率增高[10]。本研究采用HC-2技术检测标本，结果显示宫颈癌和CINⅠ～Ⅲ患者的HPV DNA含量明显高于慢性宫颈炎，且宫颈癌患者的HPV DNA含量高于CINⅠ～Ⅲ，这说明宫颈癌HPV DNA含量与宫颈的发生、发展有关，较高的HPV DNA含量可能会促进慢性宫颈炎患者逐步发展到CIN，甚至宫颈癌。

综上所述，HC-2和低温PCR检测在宫颈严重病变中有较强的一致性，低温PCR技术可对不同宫颈病变组织中HPV亚型进行检测，而HC-2可测定病变组织中的HPV DNA含量，2种检测方法对宫颈病变的筛查均有较强的应用价值。

参考文献:

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(本文编辑王艳)

通信作者：古扎丽努尔·阿不力孜，女(维吾尔族)，教授，博士生导师，研究方向：宫颈癌病因及干预研究，E-mail:gzlnr@qq.com。